Бактериологическая диагностика туберкулеза

baktubdsА. И. Каграманов, Н. А. Шмелев, Е. Д. Тимашева, О. П Архипова

Для обнаружения возбудителя туберкулеза в патологическом материале в основном пользуются бактериоскопическим и бактериологическим методами. Так как первый наиболее прост и доступен, его преимущественно и используют, несмотря на недостаточную чувствительность.

Бактериологический способ менее доступен и требует гораздо больше времени (от 7 дней до нескольких месяцев), тем не менее он применяется при диагностических исследованиях, поскольку имеет подчас решающее значение в постановке правильного диагноза, например, при дифференциации непатогенных кислотоупорных сапрофитов от туберкулезных микобактерий.

К бактериологическому исследованию обычно прибегают в случаях, когда бактериоскопический метод, включая и накопление микробов с помощью флотации, дает отрицательные результаты.Бактериологический способ исследования патологического материала распадается на следующие этапы:

  1. выделение чистой культуры микобактерий туберкулеза;
  2. диференциация ее от кислотоупорных сапрофитов;
  3. биологический метод исследования (определение вирулентности).

Выделение чистой культуры микобактерий туберкулеза осуществляют посевом исследуемого материала на питательные среды. Следует при этом иметь в виду, что мокрота, кал и т. п., наряду с туберкулезными микробактериями, содержат множество других микробов, способных быстро размножаться и подавлять рост возбудителя туберкулеза. Поэтому туберкулезный материал до бактериологического исследования следует освободить от сопутствующей микрофлоры. Для этого пользуются двумя приемами.

С одной стороны, нестерильный патологический материал предварительно (до посева) обрабатывают 3-15% раствором серной кислоты с целью уничтожения посторонних микробов, а с другой — делают посевы на яичные среды (Петраньяни, Любенау-Гона, Левенштейна), содержащие краски, задерживающие рост посторонних микроорганизмов, но не препятствующие размножению туберкулезных микобактерий.

Выделенная на яичной среде культура в дальнейшем может сохраняться на других средах. Посевы держат в термостате при 37-38° и наблюдают за появлением роста в течение 2-3 месяцев, отмечая время появления первых признаков роста. Из выросших колоний делают окрашенные мазки и проверяют кислото- и спиртоустойчивость микробов. Атипичные колонии (пигментные, гладкие, быстро растущие, легко образующие суспензию) отвивают на среды для дальнейшего изучения.

При отсутствии роста в течение 8-10 недель берут соскоб с поверхности среды и микроскопией устанавливают наличие или отсутствие микророста. В положительных случаях приготовляют взвесь из соскоба и инфицируют ее морским свинкам для определения вирулентности.

Выделение чистой культуры из того или иного патологического материала имеет свои особенности главным образом в части предварительной обработки с целью подавления жизнедеятельности сопутствующей микрофлоры. В соответствии с этим приводим описание. обработки каждого патологического материала в отдельности.

Мокрота. Наиболее распространенным методом обработки материала на туберкулез является метод Гона. При этом методе мокроту собирают в стерильные баночки в утренние часы или в течение суток. Выбирают из нее гнойные частицы. Последние исследуют в окрашенных по Цилю и Граму мазках. Затем берут около 3 мл мокроты (с гнойными комочками), добавляют 6 мл 6-10% раствора серной кислоты, энергично в течение 10 минут встряхивают до полной гомогенизации, потом центрифугируют в стерильной центрифужной пробирке, жидкость сливают, а осадок сеют на яичные среды. Действие серной кислоты (с момента добавления до момента посева, включая и время центрифугирования) должно длиться 20 минут.

Метод Мазура. В ряд широких пробирок наливают по 3 мл 2-3% раствора серной кислоты. Затем, поместив в пробирки гнойные комочки мокроты, гомогенизируют их, умеренно сильно ударяя нижними частями пробирок об упругие поверхности (ладонь, предплечье, сложенное на столе полотенце) в течение 3 минут. При этом над эмульсией мокроты образуется толстый слой пены, содержащий смесь жизнеспособных туберкулезных микобактерий и убитых посторонних микробов. Часть такой пены сеют на яичную среду.

Обработка гортанного мазка. У детей и лиц, не выделяющих мокроты, микобактерии туберкулеза часто можно обнаружить в слизи из гортани. Последнюю снимают ватным тампоном, накрученным на нарезки слегка изогнутого металлического зонда длиной 20 см и толщиной 1 мм. До употребления зонд с тампоном заворачивают в бумагу и стерилизуют обычным способом. Прежде чем взять мазок, больному предлагают покашлять и под контролем гортанного зеркала тампоном снимают слизь с гортани. Затем тампон, снятый с зонда, помещают в пробирку с 5 мл 6% раствора серной кислоты, сильно в течение 5 минут встряхивают, после чего тампон удаляют стерильным пинцетом, предварительно отжав из него жидкость в пробирку. Содержимое пробирки центрифугируют и осадок сеют на яичные среды.

Промывные воды желудка. Промывные воды желудка рекомендуют исследовать у детей, которые, как правило, не умеют отплевывать мокроту и обычно проглатывают ее, а также у взрослых, не выделяющих мокроту или выделяющих ее в незначительном количестве. В подобных случаях промывание желудка и бактериологическое исследование осадка из этих вод оказывается наиболее чувствительным методом обнаружения возбудителя туберкулеза.

Промывные воды получают с помощью желудочного зонда у больных, которым утром натощак дают выпить стакан кипяченой воды. Вытекающую через зонд жидкость собирают в стерильную посулу. Эти воды нейтрализуют 20% раствором двууглекислой соды до нейтральной по лакмусу реакции, отстаивают 1-2 часа (или центрифугируют) и исследуют гнойные частицы осадка так же, как мокроту. Обработку и посев промывных вод не следует откладывать, так как через 6 часов после взятия материала жизнеспособность туберкулезных бактерий под влиянием желудочного сока заметно ослабевает.

Кал. Кал растирают в стерильной ступке с дестиллированной водой (5 г. кала + 10 мл воды) и оставляют в покое на 30 минут. За это время крупные частицы оседают на дно. Образовавшуюся на поверхности пленку снимают стерильной ложкой, которую смывают в пробирку 10 мл 4% раствора едкого натра и выдерживают 3 часа в термостате при периодическом встряхивании. После этого взвесь центрифугируют, осадок нейтрализуют по лакмусу несколькими каплями 8-10% раствора соляной кислоты и сеют на яичные среды.

Моча. При исследовании мочи следует помнить, что микобактерий туберкулеза в ней бывает мало. Обычно берут утреннюю мочу, а иногда и суточную. Для концентрации микробов в небольшом объеме пользуются центрифугированием со скоростью 3 000-6 000 об/мин всей порции мочи. Осадок сливают в одну пробирку и исследуют бактериоскопически. При отсутствии посторонних микробов сеют без предварительной обработки серной кислотой.

В противном случае добавляют, к осадку двойной объем 6% раствора серной кислоты, перемешивают, центрифугируют и сеют полученный осадок на яичные среды (обработка кислотой, включая процедуру центрифугирования, продолжается 20 минут).

Гной, экссудат, спинномозговую жидкость центрифугируют и осадок, не содержащий посторонних микробов, сеют на среды. Если материал не стерилен, осадок обрабатывают так же, как мокроту.

Обработка кусочков органов. Кусочки органов или желез измельчают в стерильной ступке сначала ножницами, а потом пестиком до кашицеобразной консистенции, добавляют 5 мл 6-10% раствора серной кислоты. Продолжая действовать пестиком, превращают всю массу в суспензию. Последнюю центрифугируют и сеют на яичные среды. Процесс обработки кислотой, включая процедуру центрифугирования, должен длиться 20 минут.

Обработка крови. К 5 мл стерильно взятой крови добавляют 3 мл 10% раствора лимоннокислого натрия, тщательно перемешивают встряхиванием и оставляют на 2-3 часа для получения осадка (или центрифугируют). Плазму отсасывают стерильной пипеткой, осадок переносят в колбу с 40-50 мл дестиллированной воды, осторожно перемешивают круговыми движениями колбы, затем переливают в центрифужные пробирки, центрифугируют 5-10 минут при 3 000 об/мин. Осадок при центрифугировании промывают дестиллированной водой, смешивают его с 1 мл 5% раствора серной кислоты, встряхивают в течение 3 минут, добавляют 5 мл стерильной дестиллированной воды и снова центрифугируют. После этого осадок измучивают в 1 мл физиологического раствора и стерильной пипеткой сеют на питательную среду.

Молоко. Для бактериологического исследования берут свежее молоко в количестве 30 мл. Его центрифугируют в течение 15-20 минут при 3 000 об/мин. Осадок сеют на питательную среду после предварительной обработки серной кислотой.

Ускоренные методы исследования материала от туберкулезных больных

Метод Школьниковой. Нестерильный патологический материал обрабатывают 5-8-10-12% раствором серной кислоты около 20 минут (включая процесс центрифугирования), как описано выше. Осадок дважды при центрифугировании промывают дестиллированной водой (избыток кислоты задерживает рост микобактерий туберкулеза на кровяной среде). Промытый осадок засевают петлей в 3 пробирки с гемолитированной кровью.

Гемолизированная кровь готовится следующим образом: 1 часть цитратной крови кролика или барана гемолизируют добавлением 3 частей дестиллированной воды, после чего ее разливают по 5 мл в пробирки. Можно пользоваться донорской кровью, не содержащей консерванта.

Центрифужные осадки материалов, свободных от посторонней микрофлоры (экссудат, асцитическая и спинномозговая жидкость и т. п.), можно засевать в кровяную среду без предварительной обработки кислотой. Посевы (по одной пробирке) исследуют на наличие роста на 7-й, 10-й или 20-й день, причем среда с посевом центрифугируется, осадок промывается дестиллированной водой при центрифугировании для удаления кровяного пигмента, затрудняющего окраску и микроскопировяние препаратов, из промытого осадка делаются окрашенные по Циль-Нильсену мазки. Этот метод более чувствителен по сравнению с обычными посевами на яичные среды и, кроме того, заметно ускоряет получение результатов.

Метод Прайса. Изготовляют мазки из патологического материала на нескольких хорошо обезжиренных и простерилизованных обжиганием предметных стеклах. Готовые мазки сначала погружают на 5 минут в 6% раствор серной кислоты, а затем промывают погружением в стерильный физиологический раствор. Промытые препараты вносят в жидкую питательную среду (1 часть цитратной крови и 3 части дестиллированной воды). Через 7-10 дней на мазках появляется рост в виде микроколоний, которые хорошо видны под микроскопом на мазках, окрашенных по Циль-Нильсену.

Микобактерии туберкулеза и кислотоустойчивые сапрофиты

В патологических продуктах иногда вместе с бактериями туберкулеза встречаются кислотоустойчивые сапрофиты. Некоторые виды сапрофитов отличаются от туберкулезных микобактерий тем, что легче обесцвечиваются смесью спирта с кислотой. Однако ряд сапрофитов (например, М. smegmae) не только кислотоустойчив, но и спиртоустойчив. Их можно отличить от микобактерий туберкулеза только по культуральным и патогенным свойствам. При инкубации в термостате рост проявляется через несколько дней, а не через 10-20 дней, как у туберкулезных микобактерий; инокуляция кислотоустойчивых сапрофитов морским свинкам не вызывает у них патологических изменений.

Биологический метод

Наиболее чувствительным к туберкулезу лабораторным животным является морская свинка, которой пользуются при биологическом методе. С помощью этого метода можно доказать не только жизнеспособность, но и вирулентность микобактерий туберкулеза, даже при наличии единичных микобактерий в патологическом материале.

Диагностический материал, свободный от посторонней микрофлоры (серозный экссудат, спинномозговая и асцитическая жидкость и т. п.), вводят свинкам без предварительной обработки в количестве 2-3 мл. Нестерильный материал (мокрота, гной, щелочная моча и т. п.) предварительно обрабатывают 6-10% раствором серной кислоты, как при подготовке материала для посева (см. изложенное выше об обработке патологических материалов для культурального исследования). После кислотной обработки следует тщательно отмыть остатки кислоты в диагностическом материале с помощью двукратного или троекратного промывания физиологическим раствором при центрифугировании (введение плохо промытого материала вызовет некроз на месте инъекции и даже смерть подопытного животного).

Испытуемый материал вводят морским свинкам подкожно в область паха в количестве 2-3 мл. Зараженные диагностическим материалом морские свинки могут жить до 6 месяцев и дольше. Для ускорения выявления туберкулеза у свинок можно, не дожидаясь наступления смерти, взять с помощью пункции или надреза часть содержимого из регионарных паховых узлов и инфильтрат на месте инъекции и исследовать его в окрашенных мазках. Кроме того, рекомендуется проверка свинок с помощью туберкулиновой пробы. Обнаружение типичных туберкулезных микобактерий в мазках и положительная туберкулиновая проба дают право диагносцировать туберкулез у животных до вскрытия их.

В случаях, когда патологический материал, взятый у больного с активной формой туберкулеза, не вызывает генерализованного туберкулеза у морских свинок в течение 3 месяцев, необходимо пассировать слабо пораженные органы животного через новых животных.

Определение лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза

Определение лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза становится необходимым и важным методом лабораторной работы противотуберкулезных учреждений.

Определение устойчивости можно производить:

  1. «прямым» методом в полученном от больного патологическом материале (в мокроте, гнойном экссудате), если в нем бактериоскопически обнаруживают туберкулезные бактерии;
  2. «непрямым» методом, т.е. с туберкулезными штаммами, предварительно выделенными из патологического материала, если в последнем бактериоскопически туберкулезных бактерий не находят.

Определение производится путем глубинного посева на жидкую питательную среду с различным содержанием лекарственного вещества и на ту же среду без этого вещества (контроль). При прямом методе засевается непосредственно патологический материал, а при непрямом — туберкулезная культура. Результаты посева учитываются через 14 и 21 день путем сравнения роста на среде, содержащей препарат, с ростом в контроле.

Схема техники определения лекарственной устойчивости к стрептомицину (по методике Московского областного туберкулезного института). Готовят различные разведения стрептомицина в жидкой питательной среде. Для этого сначала готовят основное разведение стрептомицина путем добавления 10 мл бидестиллированной воды во флакон, содержащий 100 000 ЕД сухого стрептомицина: получается содержание 10 000 ЕД в 1 мл. Из него последовательно готовятся следующие разведения:

  1. к 0,5 мл этого разведения добавляют 4,5 мл питательной среды (без плазмы) — получается разведение 1 000 ЕД препарата в 1 мл;
  2. к 0,1 мл разведения добавляют 0,9 мл питательной среды — получается 100 ЕД в 1 мл;
  3. к 5 мл второго разведения добавляют 5 мл питательной среды — получается 50 ЕД в 1 мл;
  4. к 4 мл третьего разведения добавляют 16 мл питательной среды — получается 20 ЕД в 1 мл;
  5. к 10 мл четвертого разведения добавляют 10 мл питательной среды — получается 10 ЕД в 1 мл;
  6. к 8 мл пятого разведения добавляют 12 мл питательной среды — получается 4 ЕД в 1 мл;
  7. к 6 мл шестого разведения добавляют 6 мл питательной среды — получается 2 ЕД в 1 мл;
  8. к 3 мл седьмого разведения добавляют 9 мл питательной среды — получается 0,5 ЕД в 1 мл.

Готовится жидкая питательная среда следующего состава: двуосновной фосфорнокислый натрий (Na2 НРО4) -6,3 г. одноосновной фосфорнокислый калий (КНг Р04) — 1,4 г. лимоннокислый натрий- 1,5 г. сернокислая магнезия — 0,6 г. аспарагин — 1 г. дистиллированная вода — до 1 000 мл.

Аспарагин берется отдельно в небольшом количестве воды из общего количества; все реактивы при подогревании прибавляются последовательно, как указано в рецепте. Предварительно надо получить полное растворение каждого предыдущего реактива. Полученная смесь фильтруется, разливается во флаконы по 100 мл и стерилизуется в автоклаве. После стерилизации среда мутнеет, но потом просветляется, поэтому средой можно пользоваться через 1-2 суток после стерилизации. pH среды при таком составе оказываете, равным 7,0-7,2; в случае уменьшения pH таковой корригируются аммиаком.

При отсутствии аспарагина его можно заменить казеиновым гидролизатом в количестве 80 мл. Непосредственно перед разливкой по пробиркам к питательной среде добавляется нитратная плазма человеческой крови (без антисептиков) в количестве до 20% к общей массе питательной арены.

На постановку каждого определения требуется 14 пробирок из расчета по 2 пробирки на каждую концентрацию и 2 пробирки контроля. Готовая среда разливается по 1 мл во все пробирки. Затем в эти же пробирки (кроме контрольных) доливается по 1 мл из предварительных разведений стрептомицина (8, 7, 6, 5, 4, 3).

Таким образом, в каждой пробирке получается по 2 мл среды, содержащей соответствующую рабочую дозу стрептомицина. Поскольку в каждую пробирку с разведением стрептомицина добавляется равное количество питательной среды, то исходная концентрация стрептомицина уменьшается вдвое. В контрольные пробирки доливается по 1 мл питательной среды без стрептомицина и без плазмы.

При «прямом» методе определения устойчивости во все пробирки засевают по 0,2 мл эмульсии патологического материала после предварительной обработки его по следующей методике: материал гомогенизируется в стерильной банке с бусами, заливается двойным объемом стерильного 10% раствора трехзамещенного фосфорнокислого натрия и выдерживается 24 часа в термостате при 37°. Через сутки все содержимое банки центрифугируется путем накапливания в 1-2 центрифужных пробирках, к осадку добавляется 3 мл питательной среды без плазмы; после тщательного смешивания эта эмульсия засевается по пробиркам.

Если определение производится «непрямым» методом, то засевается эмульсия туберкулезной культуры с плотной среды, приготовленная на вышеуказанной жидкой среде без плазмы. Густота эмульсии устанавливается по бактерийному стандарту, равному 1 млрд. микробных тел в 1 мл, или же готовится по весу — 1 мг в 1 мл и засевается по 0,2 мл.

Засеянные пробирки парафинируются и выдерживаются в термостате 14 и 21 день. Учет результатов проводится следующим образом; спустя 14 дней из термостата вынимаются по одной пробирке каждой концентрации стрептомицина и по одной контрольной пробирке; содержимое пробирок центрифугируется и из осадка каждой пробирки приготовляется мазок: высохшие мазюи фиксируются 2% раствором сулемы в течение 5 минут (можно и обычным прогреванием) и окрашиваются по Циль-Нильсену; результаты определения устанавливаются по микроскопической картине роста (количество типичных микроколоний в виде кос, их величину и зрелость сравнивают с ростом в контроле).

Результаты определения фиксируются через 14 дней в следующих случаях:

  1. когда характерный микроскопический рост туберкулезных бактерий обнаруживается при концентрации стрептомицина не выше 1 ЕД в 1 мл; подобные культуры относятся к чувствительным, так как в таких случаях при более продолжительном выдерживании культур в термостате обычно не наблюдается роста на более высоких концентрациях;
  2. когда уже через 14 дней характерный рост отмечается при содержании стрептомицина, равном 10 ЕД в 1 мл и выше; подобные культуры являются устойчивыми.

В случае, если к 14-му дню типичный микроскопический рост обнаруживается при концентрациях стрептомицина в 2 и 5 ЕД в 1 мл, то результат определения фиксируется через 21 день, поскольку к этому сроку может появиться рост и при более высоких концентрациях.

Оценка полученных результатов. Устойчивость данного штамма в целом выражается той максимальной концентрацией стрептомицина (количество его ЕД в 1 мл питательной среды), при которой еще наблюдается рост, по количеству и зрелости микроколоний приближающийся к росту в контроле.

Штаммы, у которых подобный рост наблюдается при концентрации стрептомицина ниже 10 ЕД в 1 мл питательной среды, расцениваются как чувствительные, что может быть выражено соответствующими цифровыми показателями: 0,25 ЕД/мл, 1 ЕД/мл, 2 ЕД и 5 ЕД в 1 мл.

Штаммы, дающие рост, приближающийся к росту в контроле при концентрации стрептомицина 10 ЕД в 1 мл среды и выше, относятся к устойчивым и степень их устойчивости соответственно выражается показателями 10 ЕД/мл, 25 ЕД/мл и т. д.

Определение стрептомициноустойчивости туберкулезных бактерий можно производить также методом глубинного посева непосредственно патологического материала на кровяные питательные среды, пользуясь описанными выше ускоренными методами посева по Школьниковой или по Прайсу. В этом случае к питательной среде предварительно добавляется стрептомицин в различных концентрациях (от 0,5 до 100 ЕД в 1 мл).

Определение фтивазид о устойчивости проводится в принципе по той же методике, что и определение стрептомициноустойчивости. Разведения фтивазида производятся серийно, начиная с 1:32 000 по 1:32 000 000. Чувствительность культур к фтивазиду характеризуется тем последним разведением, которое полностью задерживает их пост в среде.

Штаммы туберкулезных бактерий до лечения оказываются чувствительными к фтивазиду в разведении препарата от 1:4 000 000 до 1:8 000 000. По мере повышения устойчивости к фтивазиду рост туберкулезных бактерий наблюдается в соответствии с повышением концентрации препарата (1:2000 000, 1:1 000 000, 1:125000 и т. д.).

Перевод | transfer
Метки
Bactec АБП Абсцесс Аллергия Альвеолиты Анализы БЦЖ Беременность Биопсия Бронхи Бронхит Бронхоаденит Бронхоблокация Бронхоскопия Бронхоэктазы Брюшина ВИЧ Вакцинация Витамины Гастрит Гепатит Гипертония Глаза Глотка Гортань Дезинфекция Дети Диабет Диспансер Диссеминированный Желудок Закон Зубы Иммунитет Инфильтративный КУМ Кавернозный Казеозная пневмония Кисты Кишечник Классификация Кожа Коллапсотерапия Кости Кровь Курение ЛФК Лаборатория Лазер Лимфогрануломатоз Лимфоузлы МБТ МЛУ МСЭ Менингит Микобактериоз Микоз Микроскопия Миндалины Мокрота Мониторинг Моча Мочеполовой Наркомания Нервы и психика Обследование Озонирование Опухоль Очаг Очаговый ПТК ПЦР Паротит Патогенетические Первичный Перикардит Печень Питание Пищевод Плазмаферез Плеврит Пневмокониозы Пневмония Побочные Поджелудочная Пожилые Позвоночник Посев Почки Профилактика Пьянство Рак Режимы лечения Рентген Рот Санаторий Санбюллетень Саркоидоз Сердце Симптомы Стационар Суставы Трахея Туб. интоксикация Туберкулома Устойчивость ФВД Фиброзно-кавернозный ХНЗЛ Химиотерапия Хирургия ЦНС Цирротический Шок ЭКГ Эмпиема Эндоскопия Язва