Федеральные клинические рекомендации по организации и проведению микробиологической и молекулярно-генетической диагностики туберкулеза
Черноусова Л. Н., Севастьянова Э. В., Ларионова Е. Е., Москва, 2014
Основная цель этих рекомендаций – дать объективную основу для разработки пациент-ориентированной тактики противотуберкулезной помощи и оптимизации лечения пациентов: лечение пациентов должно предотвращать смертность, рецидивы, приобретение/амплификацию устойчивости к противотуберкулезным препаратам и распространение туберкулеза.
Основной целевой аудиторией рекомендаций являются клиницисты (фтизиатры), организаторы здравоохранения вместе с другими медицинскими работниками, занятыми лечением больных туберкулезом. Рекомендации направлены на получение данных для лечения активного туберкулеза у взрослых. Они не содержат многие смежные темы, которые описаны в других публикациях.
Рекомендации содержат отдельные положения по микробиологической и молекулярногенетической диагностике туберкулеза, влияющие на принятие решения в проведении необходимой и достаточной диагностики туберкулеза, выборе необходимого режима лечения, адекватного диагностированному случаю заболевания. Они не исключают дополнительных мер диагностики, уточняющих характеристику микроорганизма, пациента и дающих возможность применять более обосновано арсенал терапевтических мероприятий.
Упоминание тех или иных компаний или названий продуктов отдельных изготовителей не означает, что РОФ отдает им предпочтение по сравнению с другими компаниями или продуктами аналогичного характера, не упомянутыми в тексте.
Диагностика пациентов с подозрением на туберкулез органов дыхания. Среди лиц, подлежащих обследованию на туберкулез или микобактериоз, в соответствии с действующим Порядком оказания медицинской помощи больным туберкулезом в Российской Федерации, обследованию с целью диагностики туберкулеза органов дыхания подлежат пациенты, имеющие кашель с мокротой, или другие пациенты, при наличии соответствующей клинико-рентгенологической картины и после консультации фтизиатра, в том числе выявленные при диспансеризации по изменениям в рентгено/флюорограммах.
Обследование пациентов с целью дифференциальной диагностики туберкулеза внелегочной локализации. Обследованию подлежат больные с длительными хроническими процессами, с выраженными клинико-лабораторными и рентгенологическими показаниями и рефракторные к неспецифической антибактериальной и/или другим методам терапии. В случае пациентов с ВИЧ инфекцией или иных случаев иммунодефицитных и иммуносупрессивных состояний, при проявлении симптомов заболеваний внелегочной локализации необходимо проведение исследований для исключения диагноза «туберкулез» или «микобактериоз».
Диагностический материал. При туберкулезе легких, наиболее распространенной и эпидемически опасной форме заболевания, доступным и часто исследуемым диагностическим материалом является мокрота. При подозрении на другие формы туберкулез органов дыхания или при невозможности собрать мокроту у пациента с подозрением на туберкулез легких, могут исследоваться и другие виды диагностических материалов (промывные воды бронхов, аспирационный материал, бронхоальвеолярный лаваж, браш-биоптат, биоптат, экссудат и др.).
Исследования внелегочных диагностических материалов проводятся только с целью дифференциальной диагностики туберкулеза внелегочной локализации, при наличии показаний, по назначению фтизиатра и/или после консультации фтизиатра соответствующего профиля. Приоритетным является подтверждение/исключение наличия микобактерий туберкулезного комплекса (МБТК) в диагностическом материале методами с максимальной доступной чувствительностью и специфичностью. В связи с этим основными методами являются культуральные исследования на жидких и/или плотных средах и молекулярно-генетические методы (МГМ).
Приоритет исследования определяется лечащим врачом и зависит от клинической ситуации, информативности предыдущих исследований. Чтобы минимизировать вероятность расхождения в результатах, полученных разными методами, комплексное исследование должно проводиться из одной аликвоты клинического материала.
Методы микроскопии. Диагностическая чувствительность метода микроскопии обычно составляет не более 50% от всех больных туберкулезом легких, однако если говорить о наиболее инфекционно-опасных больных (у которых бактериовыделение подтверждено культуральным методом), диагностическая чувствительность метода микроскопии в этом случае достигает 90%.
Методы микроскопии не позволяют дифференцировать микобактерии туберкулеза от нетуберкулезных микобактерий и дают возможность выявлять кислотоустойчивые микроорганизмы (КУМ) только при наличии, по крайней мере, 5000-10000 бактериальных клеток в мл мокроты.
В настоящее время методы микроскопии, обладающие относительно невысокой чувствительностью, сохраняют, тем не менее, свою актуальность, так как позволяют быстро и с минимальными финансовыми затратами выявлять наиболее эпидемически значимых больных туберкулезом и оценивать массивность бактериовыделения.
Методы микроскопии в обязательном порядке включаются во все схемы обследования пациентов в связи с необходимостью определения статуса бактериовыделения согласно классификатору заболеваний и дальнейшему диспансерному наблюдению пациента или при необходимости его целевой госпитализации в специализированное отделение противотуберкулезных учреждений. Современные методы микроскопии требуют обучения персонала. Методы микроскопии настоятельно рекомендуется включать в алгоритм микробиологической диагностики туберкулеза.
Микроскопия с окраской по Цилю-Нильсену. Световая микроскопия препаратов с окраской по Цилю-Нильсену (Ц-Н), приготовленных непосредственно из нативных образцов мокроты или других диагностических материалов, доступна для лабораторий всех уровней. В бактериологических лабораториях (БЛ) медицинских организаций фтизиатрического профиля субъекта РФ данный метод является актуальным при необходимости экстренного (в течение 1 часа) выявления больных туберкулезом и микобактериозом на первичном этапе обследования до госпитализации с целью определения статуса бактериовыделения.
Идентификация выросших микроорганизмов микроскопией с окраской по Цилю-Нильсену. При получении роста культуры микроорганизмов на плотной и/или жидкой питательных средах необходимо провести ее идентификацию, а также исключить наличие контаминации посторонней микрофлорой. Метод окраски по Цилю-Нильсену может быть использован для идентификации выросших микроорганизмов при отсутствии возможности использования современных молекулярных методов.
Методы люминесцентной микроскопии в бактериологических лабораториях медицинских организаций фтизиатрического профиля субъекта РФ в качестве основного метода микроскопического исследования рекомендуется применять методы люминесцентной микроскопии, где в качестве источника излучения может использоваться ртутная лампа или светодиодный излучатель (LED).
Основное преимущество люминесцентной микроскопии перед микроскопией с окраской по Цилю-Нильсену состоит в экономии времени, затрачиваемого на просмотр препарата, за счёт использования меньших увеличений объектива и, соответственно, возможности просматривать большую площадь мазка в поле зрения. Диагностическая чувствительность микроскопии с окраской люминесцентными красителями в среднем на 10% выше, чем микроскопии с окраской по Цилю-Нильсену, однако метод люминесцентной микроскопии требует значительной технической компетенции, а также более высоких капиталовложений и расходов.
Светодиодная (LED) микроскопия. LED технология позволяет сделать микроскопию более доступным анализом за счет более низкой стоимости как самих микроскопов, так и их сервисного обслуживания. Оценка, проведенная ВОЗ, подтвердила диагностическую точность LED микроскопии по сравнению с традиционной люминесцентной микроскопией и большую эффективность LED по сравнению с микроскопией по Цилю-Нильсену. Поэтому можно рекомендовать заменять традиционную люминесцентную микроскопию LED микроскопией, которая в качестве альтернативы традиционной световой микроскопии по Цилю-Нильсену может применяться как в крупных, так и в небольших лабораториях.
В связи с тем, что светодиодные люминесцентные микроскопы не требуют высококвалифицированного технического обслуживания и имеют значительно больший срок службы ламп по сравнению с обычными моделями люминесцентных микроскопов, применение данного метода является оправданным с экономической точки зрения и позволяет широко распространить технологию люминесцентной микроскопии для диагностики туберкулеза. Метод светодиодной люминесцентной микроскопии (LED) может быть рекомендован к применению вместо традиционной микроскопии/
Культуральные методы. Культуральные методы диагностики (методы посева диагностического материала на питательные среды с последующей идентификацией выросших микроорганизмов) являются основными методами выделения микобактерий туберкулеза. Их специфичность превышает специфичность микроскопических методов, а предел обнаружения значительно выше: он позволяет выявить микобактерии (МБ) при наличии в 1 мл исследуемого диагностического материала нескольких сотен и даже десятков жизнеспособных микроорганизмов.
При культивировании используют разные по составу питательные среды, дающие разные возможности роста микобактерий туберкулеза. Культивирование микобактерий обеспечивает точную диагностику туберкулеза, значительно увеличивая число случаев выявления возбудителя и позволяя подтвердить достоверность поставленного диагноза «туберкулез». Диагностическая чувствительность культурального метода достигает 70-80% среди впервые выявленных больных туберкулезом легких.
С помощью культурального метода удается выявить на 20-40% больше случаев туберкулезом с бактериовыделением по сравнению с методом микроскопии среди впервые выявленных больных. Культуральный метод позволяет выделить культуру возбудителя, необходимую для определения его видовой принадлежности и определения спектра и степени лекарственной устойчивости. Видовая идентификация выделенной культуры с помощью комплекса современных молекулярных методов позволяет сразу же дифференцировать микобактерии туберкулеза от нетуберкулезных микобактерий и неспецифической микрофлоры.
Культуральные исследования являются достаточно трудоемкими и требуют значительных капиталовложений, наличия помещений и материально-технической базы для приготовления питательных сред, обработки образцов и культивирования микроорганизмов, специализированного лабораторного оборудования и надлежащих условий, обеспечивающих биологическую безопасность. Кроме того, культуральная диагностика требует специализированного обучения персонала.
Медленный рост микобактерий туберкулеза требует значительного времени ожидания результатов исследования. В среднем, при посеве диагностического материала от впервые выявленных больных для получения результатов на плотных средах требуется 21-36 дней, на жидких средах – 12-22 дня. Методы культивирования на жидкой и плотной питательных средах могут осуществляться в бактериологических лабораториях разных уровней.
Культивирование на плотных питательных средах. Метод культивирования микобактерий на плотных средах является менее дорогостоящим, чем в системах культивирования на жидких средах, но получение роста микобактерий на плотных средах занимает гораздо более длительное время (до получения отрицательного результата – 12 недель), чем культивирование микобактерий на жидких средах (42-46 дней). Процесс приготовления плотных питательных сред (ППС) проводится в каждой бактериологической лаборатории самостоятельно и сложно поддается стандартизации.
Однако указанный метод позволяет получить культуру микобактерий для проведения её дальнейших исследований и может быть рекомендован для использования в бактериологической лаборатории на всех этапах диагностики и контроля химиотерапии. Метод культивирования на плотной питательной среде остаётся востребованным и рекомендуется к использованию в лабораторной практике для диагностики туберкулеза в комплексе с другими методами исследования/
Культивирование на жидкой питательной среде в автоматизированной системе учета роста микроорганизмов. С 2006 г. международным сообществом были одобрены несколько новых тестов и диагностических подходов, включая использование жидких питательных сред с быстрой идентификацией в качестве стандартного эталона для подтверждения этиологии заболевания.
Культивирование на жидкой среде повышает выявление микобактерий примерно на 10% по сравнению с плотными питательными средами. В настоящее время широко используются системы с автоматической детекцией учета роста микобактерий, которые позволяют значительно ускорить получение результата. В бактериологических лабораториях медицинских организаций фтизиатрического профиля РФ преобладающей является автоматизированная система BACTEC MGIT 960/320.
Преимущества автоматизированной системы культивирования BACTEC MGIT 960/320 перед культуральными исследованиями на плотных питательных средах обеспечиваются высокой эффективностью стандартизованных и сертифицированных по ISO9001 производств реагентов и сред, а также поддержанием стандартных протоколов исследований. Посев на жидкие питательные среды настоятельно рекомендуется при диагностических исследованиях, для обследования впервые выявленных больных и повторных случаев лечения.