Характеристика диагностических методов во фтизиатрии

emtb5В.И. Голышевская, Э.В. Севастьянова, М.В. Шульгина

Все методы диагностики заболеваний можно разделить на прямые, позволяющие выявить непосредственно этиологический агент заболевания, и косвенные, которые выявляют последствия воздействия этиологического агента на организм больного. В случае туберкулеза к прямым методам относятся традиционные методы микробиологической диагностики (микроскопия и посев) и ПЦР-диагностика, позволяющая определять наличие ДНК возбудителя в диагностическом материале. К косвенным методам относятся результаты клинического обследования; обследования лучевыми методами, фиксирующими последствия воздействия микобактерий на ткани органов пациентов; определение иммунного ответа организма.

Все применяемые методы диагностики характеризуются такими показателями, как диагностическая чувствительность и диагностическая специфичность. Диагностическая чувствительность определяется как доля правильно определенных пациентов, страдающих данным заболеванием, от всех обследованных пациентов с заболеванием. Диагностическая специфичность определяется как доля правильно определенных здоровых пациентов среди всех обследованных здоровых пациентов.

Диагностическая специфичность косвенных методов невелика. Анализ эффективности массовых флюорографических обследований, проводившихся в Российской Федерации на протяжении многих лет, показал, что имеющиеся в этом случае большие экономические затраты не всегда оправдывают себя в связи с низким процентом выявления больных туберкулезом, высокой долей ошибочных диагнозов и трудностями с привлечением бессимптомных больных к лечению. Кроме того, этот вид обследования не охватывает социальные группы, наиболее подверженные заболеванию туберкулезом, что приводит к снижению чувствительности метода при массовом скрининге.

Микробиологические методы характеризуются высокой специфичностью. Видовая идентификация выделенной культуры микобактерий позволяет исключить этиологические агенты нетуберкулезной этиологии более чем в 99 случаях из 100. Специфичность микроскопии для выявления КУМ ниже, однако, в странах с заболеваемостью более 50/100 000 населения – выявленные КУМ в 95% случаев окажутся микобактериями туберкулеза. Диагностическая чувствительность метода посева достигает 80-90%, метода микроскопии ниже – не более 50% от всех больных туберкулезом. Однако если говорить о наиболее инфекционных больных, диагностическая чувствительность микроскопии в этом случае достигает 90%.

emtb4

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), внедряемая для диагностики туберкулеза в последние годы, показала высокую специфичность (99,8%) и чувствительность (более 85%) в лабораторных испытаниях. Однако при применении этого метода в клинике и специфичность, и чувствительность оказались значительно ниже. Это объясняется высокими требованиями к условиям проведения анализа, исключающими перекрестный перенос фрагментов молекул ДНК (РНК); сложностями, связанными с экстракцией ДНК (РНК) из инфекционного материала; а также необходимостью обеспечить высокий уровень подготовки персонала. В рядовых клинических лабораториях добиться выполнения всех требований к осуществлению метода удается не всегда. Кроме того, с учетом вышеперечисленных требований стоимость аппаратуры и тест-наборов делает этот метод дорогостоящим. В настоящее время он не нашел широкого распространения и ни в одной стране не стал альтернативой микробиологическим методам. Этот метод применяется как дополнительный.

В современной напряженной эпидемической ситуации с туберкулезом микробиологические исследования играют важную роль в диагностике заболевания, контроле бактериовыделения в процессе лечения, выборе рациональных схем и коррекции химиотерапии, оценке ее эффективности, микробиологическом подтверждении излечения больного после окончания курса лечения. В последние годы в связи с ростом показателей заболеваемости микробиологические методы исследования являются одними из основных методов в диагностике туберкулеза. При достаточных ресурсах, направляемых на Программу борьбы с туберкулезом, используются и другие диагностические методы. В последние годы в практику лабораторной диагностики туберкулеза все шире внедряются новые методы, которые основываются на молекулярно-генетических технологиях. Молекулярно-генетические методы с успехом применяются для подтверждения принадлежности выявленных методом микроскопии КУМ к микобактериям туберкулеза, а также для предварительной диагностики случаев с МЛУ МБТ. Однако в этом случае окончательный диагноз лекарственной устойчивости МБТ к противотуберкулезным препаратам ставится, тем не менее, на основании микробиологических тестов на лекарственную чувствительность.

Кроме того, высокая стоимость таких методов, как ПЦР-диагностика, высокие требования к оснащению лабораторий и профессиональной подготовке персонала ограничивают применение этих методов в периферийных лабораториях и небольших лабораториях среднего уровня. Таким образом, в последние годы, в условиях напряженной эпидемической ситуации по туберкулезу и в связи с уменьшением объема проводимых массовых флюорографических обследований населения, в РФ значительно возросла роль традиционных методов микробиологической диагностики. Первичное выявление больных туберкулезом микробиологическими методами в РФ осуществляется как в учреждениях противотуберкулезной службы, так и в клинико-диагностических лабораториях общей лечебной сети.

Методы микроскопического исследования

Способность микобактерий к кислотоустойчивому окрашиванию позволяет обнаруживать их в мазках из диагностического материала с высокой специфичностью. Для этого мазки обрабатывают растворами карболовых производных анилиновых красителей. Наиболее распространенными являются карболовые производные основного фуксина или люминесцентного красителя аурамина. Наиболее распространенным методом для выявления кислотоустойчивых микобактерий является метод окраски мазков по Цилю-Нильсену. Этот метод широко применяется в клинико-диагностических лабораториях общей лечебной сети для окраски мазков, приготовленных непосредственно из диагностического материала (метод прямой микроскопии), и является достаточно эффективным.

В методе Циля-Нильсена в качестве красителя используется основной карболовый фуксин. При одновременном воздействии нагревания и сильного протравливающего вещества, дестабилизирующего клеточную стенку, – фенола (карболовой кислоты), на котором готовится основное красящее вещество фуксин, облегчается проникновение анилинового красителя в микобактериальную клетку и особенно в структуры ее клеточной стенки, состоящей из липидов и миколовых кислот. Обычные анилиновые красители не воспринимаются микобактериями, и последние не окрашиваются. Такая трудная окрашиваемость микобактерий туберкулеза связана с тем, что в их состав входит значительный процент жировосковых веществ; особенно много их содержится в оболочке, поэтому для окраски микобактериальной клетки требуется первоначально разрыхлить ее оболочку.

Для проявления способности к кислотоустойчивому окрашиванию требуется целостность микобактериальной клетки и ее внешней оболочки. Карболовый фуксин проникает внутрь клетки, а также связывается с остатками миколовых кислот, входящих в состав пептидогликолипидной внешней оболочки микобактериальной клетки. Связывание карболового фуксина с миколовыми кислотами повышает гидрофобность клеточной оболочки и препятствует выходу красителя из клетки. Краситель, содержащийся внутри клетки, обеспечивает яркость окраски, окраска внешней оболочки имеет бледно-красный цвет. Последующее обесцвечивание мазка серной кислотой в высокой концентрации или солянокислым спиртом приводит к обесцвечиванию всех некислотоустойчивых микроорганизмов. Только микобактерии, обладающие выраженной кислотоустойчивостью и спиртоустойчивостью, стойко удерживают краситель и остаются окрашенными в малиново-красный цвет.

Микобактерии туберкулезного комплекса характеризуются высокой степенью кислотоустойчивости. Сапрофитные виды микобактерий, как правило, значительно менее устойчивы к обесцвечиванию, чем вирулентные штаммы. Поэтому, для того чтобы отличить микобактерии туберкулезного комплекса от менее кислотоустойчивых сапрофитных микобактерий, предпочтительнее всего использовать для обесцвечивания мазка 25% серную кислоту. Последующая (после 25% серной кислоты) обработка мазка 96° этиловым спиртом не является обязательной при проведении процедуры кислотоустойчивого окрашивания, однако обеспечивает полное удаление с мазка кристаллов и остатков краски. Указанный способ двойной обработки позволяет добиться надежных результатов обесцвечивания окрашенного мазка и избежать гипердиагностики КУМ.

Обесцвеченный мазок докрашивают метиленовым синим. Таким образом, при окраске по Цилю-Нильсену кислотоустойчивые микобактерии выглядят ярко-красными на синем фоне препарата. Для исследования мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену, используют световой бинокулярный микроскоп с иммерсионным объективом (х90 или х100) и окуляром х7-10. Обычно исследуют 100 полей зрения, что достаточно для выявления в мазке единичных микобактерий. В том случае, если результат такого исследования оказывается отрицательным, для подтверждения рекомендуется просмотреть еще 200 полей зрения. Результаты регистрируют указанием количества обнаруженных кислотоустойчивых бактерий – КУМ. Чтобы обнаружить микобактерии туберкулеза при проведении микроскопии методом Циля-Нильсена, в 1 мл мокроты должно содержаться от 5000 и более микробных клеток.

Количество мокроты, наносимой на предметное стекло при приготовлении мазка, составляет примерно 0,01 мл. Это количество мокроты распределяется на площади 200 мм2. Поскольку площадь поля при микроскопии с масляной иммерсией составляет примерно 0,02 мм2, то для исследования всего мазка нужно просмотреть 10 000 таких полей. Если просмотреть 100 полей, то можно считать, что исследован всего 1% площади мазка. Если в пробе мокроты находится 5000 микобактерий на 1 мл, то весь мазок будет содержать 50 микроорганизмов. Если эти 50 микобактерий равномерно распределены среди 10 000 полей мазка, то на каждые 200 полей придется по одной микобактерии. Если просмотрено 100 полей, вероятность обнаружения этой микобактерии составит 50%.

Для того чтобы найти в мазке хотя бы 3 кислотоустойчивые микобактерии (что обычно рекомендуется как необходимый минимум для признания данного мазка положительным), необходимо просмотреть 600 полей зрения. При просмотре 300 полей вероятность обнаружения трех микобактерий составит примерно 50%. Для обнаружения одной кислотоустойчивой микобактерии в 10 полях (или 10 в 100 полях) необходимо присутствие 1000 таких микобактерий в мазке (10 000 полей) или 100 000 (105) в 1 мл мокроты. Для обнаружения одной микобактерии в каждом поле их должно быть 106 в 1 мл мокроты.

Метод микроскопии позволяет выявить лишь 50-60% от всех больных туберкулезом. Однако в случае проведения диагностики у больных с массивным бактериовыделением, представляющих собой наибольшую эпидемическую опасность, чувствительность метода превышает 90%. Специфичность же этого метода очень высока – 98% и выше. В мокроте больных с активными формами туберкулеза легких (особенно при наличии у больных полостей распада легочной ткани) обычно содержится значительное количество кислотоустойчивых бактерий, что позволяет выявить их при бактериоскопии. Чувствительность метода микроскопии можно повысить, если просматривать несколько мазков от одного пациента. Поэтому при подозрении на туберкулез легких необходимо проводить бактериоскопию мазков из трех различных образцов мокроты, собранных в течение 3 дней.

В первой порции мокроты от больного туберкулезом КУМ обнаруживают, как правило, в 80-90% случаев. Еще 5-25% выявляются при исследовании второй порции мокроты. До 5% бациллярных случаев выявляются при исследовании третьего мазка. Дальнейшие исследования мокроты могут дополнительно выявить единичные случаи. Однако исследование более чем 3 порций мокроты применяется в исключительных случаях. Обычно в противотуберкулезных программах число исследований для диагностики устанавливают с учетом возможности лабораторной сети справиться с нагрузкой, как правило в количестве 2 или 3. В России число исследуемых мазков для диагностики туберкулеза установлено Приказом МЗ РФ № 109 как 3 мазка.

Наиболее результативным является исследование утренней порции мокроты. Поэтому исследование трех образцов мокроты, собранных утром на протяжении трех последующих дней, представляет собой предпочтительную схему обследования. Однако возможны и другие схемы обследования пациентов с подозрением на туберкулез. Отрицательный результат бактериоскопического исследования не исключает диагноз туберкулеза, так как в мокроте некоторых пациентов содержится меньше микобактерий, чем может выявить микроскопия. Вероятность наличия туберкулеза с положительным мазком у пациента с кашлем более 14 дней значительно выше, чем у пациентов с кашлем менее чем в течение 14 дней. В связи с этим обследованию методом микроскопии подлежат лица только при наличии у них длительного кашля с мокротой! В настоящее время в РФ массовые флюорографические осмотры населения, как правило, не проводятся и основная масса впервые заболевших туберкулезом выявляется по обращаемости, то есть среди лиц, обратившихся за медицинской помощью из-за появившихся различных клинических симптомов.

В первую очередь микроскопическому обследованию подлежат обратившиеся в медицинские учреждения лица с явными симптомами заболевания:

  • наличие продолжительного (более 3 недель) кашля, сопровождающегося выделением мокроты, мокроты с кровью и болью в груди,
  • наличие субфебрильной или фебрильной температуры, профузных ночных потов, симптомов интоксикации,
  • потеря веса.

Помимо этого, микроскопические исследования мазков, окрашенных методом Циля-Нильсена, проводятся при первичном обследовании лиц, подозреваемых на наличие у них туберкулезного заболевания:

  • контактировавшие с больными, имеющими положительный результат бактериоскопического исследования и соответствующие симптомы заболевания;
  • имеющие рентгенологические изменения в легких, подозрительные в отношении туберкулеза;
  • при активном обследовании лиц, входящих в группы риска по заболеванию туберкулезом.

Целесообразный подбор пациентов для обследования (при наличии у них симптомов, подозрительных в отношении туберкулезной инфекции) позволяет значительно повысить эффективность микроскопического исследования. Еще одной причиной низкой эффективности микроскопии для выявления КУМ является низкое качество диагностического материала. В случае если вместо мокроты в лабораторию доставлена слюна, вероятность обнаружения в ней КУМ даже у бациллярного больного невелика. Однако она не равна нулю. Поэтому не рекомендуется отказываться от исследования доставленного в лабораторию материала, каким бы он ни был.

Однако лаборатория должна отмечать факт исследования слюны в лабораторном журнале и в форме ответа врачу, поскольку в случае отрицательного результата анализа такого материала, как слюна, лечащий врач не должен принимать его во внимание и должен повторить исследование. Лаборатория также должна принять меры для снижения доли слюны среди поступающих в лабораторию образцов диагностического материала. Этот вопрос можно решить путем обучения сборщиков мокроты, а также информирования и разъяснительной работы с лечащими врачами. Плохая подготовка мазков мокроты, ошибки в их окрашивании и неисправный микроскоп также могут быть причиной отрицательного результата бактериоскопического исследования. Помимо метода Циля-Нильсена, для бактериоскопии мазка применяется окраска флюорохромами для люминесцентной микроскопии.

Метод люминесцентной микроскопии является более эффективным по сравнению с методом Циля-Нильсена. Однако в тех случаях, когда мазок подвергается окраске флюорохромными красителями и исследуется в люминесцентном микроскопе, необходимо иметь в виду, что качественная и эффективная окраска флюорохромными красителями требует обязательного соблюдения кислотности (рН) мазка, а также освобождения микобактерий от окружающей их слизи, которая препятствует проникновению красителя в микробную клетку. Несоблюдение этих условий приводит к снижению эффективности люминесцентной микроскопии и получению ложноотрицательных результатов исследования.

В связи с этим метод люминесцентной микроскопии не рекомендуется применять для исследования нативной мокроты, мазки для люминесцентной микроскопии необходимо готовить из осадка, полученного путем обработки материала детергентом с последующим отмыванием либо нейтрализацией и центрифугированием при 3000 g в безопасной центрифуге. В дополнение к такой центрифуге необходимо создание в лаборатории специальных условий безопасности (автономная вентиляция, снабженная НЕРА-фильтрами на выходе, и ее регулярное обслуживание). Поэтому данный метод обычно используется только в специализированных бактериологических лабораториях, которые, помимо микроскопического, выполняют еще и культуральное исследование, при этом мазок и посев производятся обязательно из одной и той же порции материала.

Суть люминесцентной микроскопии заключается в том, что объекты (клетки), окрашенные специальными красителями (флюорохромами), дают излучение в видимом спектре света под действием облучения их ультрафиолетом. При обработке микобактерий флюорохромными красителями (аурамин, родамин и др.) последние связываются с воскоподобными структурами микробной клетки. При облучении окрашенных клеток возбуждающим источником света (определенный спектр ультрафиолетового излучения) они начинают светиться оранжевым или ярко-красным светом на черном или темно-зеленом фоне. В силу высокой контрастности видимого изображения (цветные светящиеся объекты на темном фоне) при исследовании такого мазка можно снизить общее увеличение микроскопа в несколько раз, что позволяет расширить поле зрения в 4-10 раз и уменьшить время, необходимое для просмотра мазка. Наряду с этим за счет значительно большей глубины резкости и контрастности микроскопической картины повышается комфортность микроскопического исследования, а также расширяются пределы метода. Это делает метод люминесцентной микроскопии особенно ценным при исследовании олигобациллярного материала. Чувствительность люминесцентной микроскопии, особенно в сочетании с методом обогащения диагностического материала (микроскопия осадка), незначительно уступает по чувствительности методу посева. Люминесцентная микроскопия позволяет выявить от 500 микробных клеток в 1 л мокроты, что значительно увеличивает диагностическую эффективность метода.

Основное преимущество люминесцентной микроскопии состоит в том, что этот метод позволяет проводить исследование при меньших увеличениях микроскопа и, следовательно, просматривать большую площадь мазка в одном поле зрения. Окрашенные флюорохромными красителями препараты обычно исследуются при увеличении х250-450, тогда как окрашенные фуксином – при увеличении х1000. Применение малых увеличений позволяет за одно и то же время тестировать методом люминесцентной микроскопии большее количество полей зрения, чем при использовании обычного микроскопа проходящего света. Кроме того, окраска клеток смесью аурамина и родамина является специфической для кислотоустойчивых микобактерий, которые окрашиваются в виде золотистых палочек. Сапрофиты окрашиваются в зеленоватый цвет. Другим важным преимуществом метода люминесцентной микроскопии является способность обнаруживать измененные микобактерии, утратившие под влиянием ряда неблагоприятных факторов, в частности интенсивной химиотерапии, свойство кислотоустойчивости и не выявляющиеся в связи с этим при окраске по методу Циля-Нильсена. Благодаря возможности использования для люминесцентной микроскопии объективов с малым увеличением, поле зрения оказывается во много раз больше, чем при использовании масляной иммерсии: размер поля в первом случае при объективе х25 составляет примерно 0,34 мм2, а в последнем – всего около 0,02 мм2. Таким образом, при использовании люминесцентной микроскопии на просмотр той же площади мазка затрачивается значительно меньше времени, чем при обычной микроскопии мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену. Так, если за рабочий день микроскопист просматривает примерно 30-40 мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену, то с помощью люминесцентной микроскопии он просмотрит за то же время более 200 мазков.

Поскольку методом люминесцентной микроскопии за то же время можно просканировать в 15 раз больше полей, чем при микроскопии мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену, вероятность обнаружения кислотоустойчивых бактерий при использовании первого метода значительно повышается, особенно если в мазке содержится мало микобактерий. Это было подтверждено сравнительным исследованием, которое показало, что за 1 мин люминесцентная микроскопия позволяла выявить больше положительных и не больше ложноположительных результатов, чем микроскопия мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену, за 4 мин. Сравнение положительных результатов люминесцентной микроскопии и микроскопии мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену, с результатами посева выявило некоторое преимущество люминесцентной микроскопии: из всех препаратов, оказавшихся положительными по результатам посева, 67,3% были положительными по данным люминесцентной микроскопии и 66,1% по данным микроскопии с использованием окраски по Цилю-Нильсену (Томан, 1980).

Считается, что недостатком люминесцентной микроскопии является то обстоятельство, что при ее использовании повышается вероятность получения ложноположительных результатов. Однако такой фактор, как использование для люминесцентной микроскопии объектива с меньшим увеличением (по сравнению с обычным микроскопом проходящего света) не оказывает существенного влияния на возможность получения ложноположительных результатов. Гораздо большее значение имеет сочетание запирающих и возбуждающих светофильтров, то есть цвет свечения, а также наличие или отсутствие фонового свечения, которые влияют на общий цвет свечения, что и может явиться основной проблемой. Следует отметить, что в литературе описаны специально проведенные исследования, которые показали, что существовавшие опасения по поводу возможной неспецифичности флюоресцентного метода оказались напрасными (Томан, 1980). Согласно этим исследованиям, метод люминесцентной микроскопии и метод Циля-Нильсена практически не различаются по числу ложноположительных результатов. Приблизительно 97% положительных результатов, полученных любым методом микроскопии, были однозначно подтверждены результатами посева. Тем не менее во всех сомнительных случаях в качестве контроля должна использоваться микроскопия мазка, окрашенного по методу Циля-Нильсена.

К недостаткам метода люминесцентной микроскопии относится сравнительно высокая стоимость полной микроскопической установки и ее эксплуатации. Однако в центральных или других крупных лабораториях, где нагрузка превышает норму трех лаборантов, работающих с тремя обычными микроскопами, дешевле пользоваться вместо этого одним люминесцентным микроскопом. Другой недостаток метода люминесцентной микроскопии состоит в том, что работа с оптическим оборудованием и уход за ним требуют специальных технических навыков.

Роль микроскопических исследований для выявления туберкулеза

Выявление микобактерий в диагностическом материале от больных имеет решающее значение для постановки диагноза «туберкулез». Бактериоскопический метод исследования является простым и экономичным способом, указывающим на наличие или отсутствие кислотоустойчивых бактерий и позволяющим при положительном результате исследования мазка мокроты устанавливать диагноз «туберкулез легких». При проведении микроскопического исследования допустимы 2 метода – метод прямой микроскопии, когда мазок приготавливается непосредственно из диагностического материала, и метод микроскопии мазка из осадка, подготовленного из обработанного деконтаминантами материала для культурального исследования. Центрифугирование, концентрирующее образец, увеличивает чувствительность метода микроскопии. Однако некоторые исследования показали, что правильный выбор гнойных комочков мокроты для приготовления мазков позволяет достичь неменьшей эффективности, чем та, что достигается при обработке и центрифугировании мокроты. Таким образом, хорошо обученный и мотивированный лаборант и правильно подобранные контейнеры для сбора мокроты (плоские и прозрачные) могут эффективно компенсировать отсутствие в лаборатории скоростной безопасной центрифуги.

В РФ метод микроскопического исследования мазков, приготовленных из нативной мокроты и окрашенных по Цилю-Нильсену, широко используется в тех лабораториях, где производится только микроскопическое исследование материала (клинико-диагностические лаборатории общей лечебной сети). Если материал подвергается микробиологическому исследованию в лаборатории более высокого уровня, то микроскопическое исследование проводят параллельно с культуральным исследованием из одной пробы полученного материала. При этом мазки обычно готовят из осадка диагностического материала, что позволяет получать оптимальные результаты микроскопического исследования. Осадок представляет собой обогащенную фракцию диагностического материала и значительно чаще позволяет получить положительные результаты (при этом осадок может быть окрашен как флюоресцентными красителями, так и по методу Циля-Нильсена).

Необходимо отметить, что при микроскопическом исследовании мазка из диагностического материала нельзя определить видовую принадлежность выявленных кислотоустойчивых микобактерий и специфически идентифицировать возбудитель туберкулеза. Метод микроскопии позволяет дать заключение лишь о наличии или отсутствии в препарате кислотоустойчивых микроорганизмов, что объясняется существованием в природе большого числа микроскопически неотличимых от микобактерий туберкулеза нетуберкулезных кислотоустойчивых бактерий. Кислотоустойчивость при микроскопическом исследовании в сочетании с морфологическим показателем (палочковидные формы) способствует выявлению микобактерий, не доказывая, однако, что речь идет о микобактериях туберкулеза. При микроскопическом исследовании препаратов морфологически очень трудно отличить кислотоустойчивые сапрофитные микобактерии от туберкулезных. Поэтому метод микроскопии позволяет в короткий срок дать ответ клиницистам только о наличии в мокроте больного кислотоустойчивых микобактерий (КУМ), к которым относятся и микобактерии туберкулеза. При значительной заболеваемости туберкулезом вероятность того, что обнаруженные КУМ являются микобактериями туберкулеза, превышает 95-98%. Вероятность того, что выявленные КУМ являются микобактериями туберкулеза, зависит также от полученного для исследования материала и от способа его получения. Например, при исследовании мочи вероятность, что обнаруженные КУМ являются сапрофитными микобактериями, значительно выше, чем при исследовании мокроты.

Следует также отметить, что кислотоустойчивость микобактерий не является фиксированным и обязательным свойством клетки и что в начальной фазе своего развития культура микобактерий может содержать некислотоустойчивые формы. Поэтому микроскопическое исследование материала с целью выявления КУМ не дает полной уверенности в наличии либо отсутствии в диагностическом материале возбудителя туберкулеза ни при положительном, ни при отрицательном результате бактериоскопии. В связи с этим, как правило, микроскопический метод сопровождается более чувствительным и результативным методом исследования – методом посева. Тем не менее микроскопические исследования играют очень важную роль в выявлении и диагностике туберкулеза. Диагностика туберкулеза легких бактериоскопическим методом проста, достаточно эффективна, экономически выгодна, так как не требует особого оборудования и химических реактивов. Преимуществом бактериоскопического метода исследования является также быстрота получения результата. Данный метод позволяет в короткие сроки выявить наиболее эпидемически опасных больных туберкулезом.

Культуральные методы диагностики туберкулеза

Культуральный метод – метод посева диагностического материала на питательные среды – является основным методом выделения микобактерий туберкулеза. Культуральный метод, так же как и метод микроскопии, относится к прямым диагностическим методам. Его специфичность превышает специфичность микроскопических методов, а чувствительность значительно выше: он позволяет выявить МБТ при наличии в 1 мл исследуемого диагностического материала нескольких десятков жизнеспособных особей. Кроме того, очень важным преимуществом метода культурального исследования перед методом микроскопии является то, что он позволяет выделить культуру возбудителя, которая может быть подробно исследована с определением ее видовой принадлежности, спектра лекарственной устойчивости, вирулентности, молекулярногенетических характеристик и других свойств. К недостаткам метода можно отнести его высокую стоимость, сложность обработки диагностического материала, а также медленный рост микобактерий туберкулеза, обуславливающий необходимость длительного ожидания результатов исследования (от 14 дней до 12 недель).

Данные показывают значительно большую чувствительность культурального метода по сравнению с методом микроскопии, а также высокую специфичность. Однако стоимость культурального метода (включая оборудование, обеспечивающее саму технологию посева и безопасность работы, а также более высокий уровень подготовки персонала) значительно выше, чем для метода микроскопии с окрашиванием по Цилю-Нильсену. Время, затрачиваемое на получение результата при посеве, также значительно выше, чем при прямой микроскопии: при использовании плотных яичных сред оно составляет в среднем 21-28 дней для положительного результата и до 20 недель для отрицательного результата. Использование жидких сред и автоматических анализаторов позволяет значительно снизить время культивирования, однако оно все равно достигает 7-14 дней. При этом стоимость оборудования, реактивов и расходных материалов возрастает многократно.

В связи с высокой стоимостью культуральных исследований, в большинстве противотуберкулезных программ их использование ограничивается случаями, когда:

  • при наличии симптомов туберкулеза результаты трех микроскопических исследований оказались отрицательными;
  • есть необходимость исследовать лекарственную чувствительность штамма-возбудителя (в связи с высоким уровнем распространенности лекарственной устойчивости – для всех новых случаев и случаев повторного лечения; в случае контакта пациента с больным с МЛУ-туберкулезом, неудачи лечения, а также при проведении исследования распространенности лекарственной устойчивости);
  • при необходимости определить вид возбудителя (при высоком уровне распространения нетуберкулезных микобактерий или микобактерий бычьего вида);
  • при диагностике внелегочного туберкулеза, туберкулеза у детей и ВИЧ-инфицированных пациентов.

В Российской Федерации, согласно Приказу № 109, подтверждение диагноза для всех случаев туберкулеза, так же как и контроль эффективности лечения (ежемесячно), осуществляется методом посева. Для культуральной диагностики применяются как жидкие, так и плотные питательные среды. Основными плотными питательными средами являются яичные среды Левенштейна-Йенсена и Финна-2, главными ростовыми компонентами которых являются L-аспарагин и глутамат натрия, которые имеют исключительную ростовую ценность для микобактерий туберкулеза. Перед посевом диагностический материал подвергают деконтаминации, основной целью которой является удаление нетуберкулезной микрофлоры. В этом случае используют свойство повышенной устойчивости микобактерий туберкулезного комплекса к кислотам и щелочам. Идеальный деконтаминант должен убивать всю нетуберкулезную микрофлору, полностью сохраняя жизнеспособность микобактерий туберкулезного комплекса. К сожалению, идеального деконтаминанта не существует: убивая нетуберкулезные микроорганизмы, любой из известных деконтаминантов уничтожает и часть популяции туберкулезных микобактерий. Поэтому необходимо строгое соблюдение методов пробоподготовки (прописей деконтаминации) и постоянный мониторинг ее эффективности по доле проростов среди посевов диагностического материала.

Оптимальный уровень проростов составляет 2-5%. При превышении 5% уровня деконтаминация недостаточна, или помещение лаборатории загрязнено посторонней микрофлорой, или не соблюдается температурный режим в термостатной комнате (в термостатах), или время доставки материала из места его сбора в лабораторию слишком велико. При уровне проростов менее 2% деконтаминация избыточна и, вместе с посторонней микрофлорой, теряются и культуры микобактерий туберкулезного комплекса. Деконтаминация избыточна также и в том случае, если в лаборатории не выделяют нетуберкулезные микобактерии. После посева пробирки помещают в термостат для инкубации при температуре 37 °С. Рост микобактерий туберкулеза чаще наблюдается на 3-6-й неделе, однако возможен более ранний и более поздний рост, в связи с чем посевы просматривают каждые 7-10 дней и выдерживают в термостате до 10-12 недель. Регистрация результатов посева при наличии роста микобактерий туберкулеза проводится с указанием количества обнаруженных колоний.

Огромное внимание в микробиологической диагностике туберкулеза уделяется определению лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза к антибактериальным препаратам, поскольку лекарственная устойчивость возбудителя является одним из существенных факторов, ограничивающих эффективность химиотерапии. Причины развития лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза могут быть следующими: неадекватные схемы лечения больных, несоблюдение дозировок и режима лечения, низкое качество препаратов, неправильное использование антибактериальных препаратов в общей лечебной сети. Принято разделять два вида лекарственной устойчивости МБТ: первичная (начальная) и вторичная (приобретенная). Первичная лекарственная устойчивость – это устойчивость, выявленная у штаммов, выделенных от никогда ранее не лечившихся от туберкулеза (или лечившихся в течение менее 1 месяца) больных до начала лечения. Распространенность устойчивости этого типа отражает уровень распространенности лекарственно устойчивых штаммов на данной территории. Второй вид устойчивости – вторичная, или индуцированная, устойчивость, которая развивается в результате неэффективной химиотерапии и характеризует эффективность противотуберкулезных программ. В основе лекарственной устойчивости МБТ лежат изменения в генотипе штаммов микобактерий, меняющие чувствительность бактериальной клетки к противотуберкулезным препаратам.

Для первичной ЛУ характерна высокая стабильность и наследственная закрепленность, независимо от контакта с антибиотиком. Этот вид лекарственной устойчивости наблюдается у больных при заражении устойчивыми штаммами от больных туберкулезом. Вторичная ЛУ возникает в результате приема определенных концентраций антибактериальных препаратов. Таким образом, согласно современной международной классификации ЛУ МБТ подразделяют на лекарственную устойчивость среди впервые выявленных больных туберкулезом (новые случаи) и лекарственную устойчивость среди ранее леченных больных. Для определения лекарственной устойчивости МБТ в лабораторной практике обычно применяются широко апробированные стандартные методы, наиболее распространенными из которых являются метод пропорций и метод абсолютных концентраций.

В микробиологических лабораториях большинства стран мира используется метод пропорций (метод определения процента устойчивой популяции). Данный метод основан на сравнении количества выросших колоний на среде с препаратом и на среде без препарата с различными концентрациями бактериальной суспензии. Это дает возможность вычислить процент жизнеспособной популяции при определенной концентрации препарата и определить соотношение устойчивых и чувствительных особей МБТ в исследуемой культуре. Штамм считается устойчивым к препаратам первого ряда (изониазиду, рифампицину, стрептомицину и этамбутолу) в том случае, если число выросших колоний на среде с препаратом составляет более 1%. В лабораториях России широкое применение нашел метод абсолютных концентраций, который официально утвержден Приказом МЗ РФ № 109. Этот метод основан на определении концентрации противотуберкулезного препарата, ингибирующей рост культуры микобактерий при выращивании их на средах с различным содержанием препаратов. Для обоих методов используется международная питательная среда Левенштейна-Йенсена, результаты учитываются на 21-й день (для метода абсолютных концентраций) или на 28-й день (для устойчивых штаммов при методе пропорций) и 40-й день (для чувствительных штаммов при методе пропорций) после посева микобактериальной суспензии. Во многих странах применяется модифицированный метод пропорций, когда учет устойчивости и чувствительности МБТ осуществляется на 28-й день.

Основным недостатком традиционных методов определения ЛУ МБТ являются длительные сроки получения результатов, обусловленные медленным ростом микобактериальной популяции. Длительность лабораторного исследования в целом и длительность определения лекарственной чувствительности возбудителя в частности крайне важна как для лечения больного, так и контроля за распространением туберкулезной инфекции. За последнее десятилетие современный диагностический арсенал значительно расширился за счет ускоренных культуральных и молекулярно-генетических методов идентификации видов микобактерий, а также тестирования лекарственной чувствительности возбудителя.

В настоящее время для сокращения сроков выращивания микобактерий туберкулеза и ускоренного определения лекарственной устойчивости широко применяются методы с использованием жидких питательных сред и автоматизированных систем: BACTEC 460 (Becton Dickinson), BACTEC – MGIT 960 (Becton Dickinson), BACTEC 9000 MB (Becton Dickinson), MB/BacT/Alert 3D (BIOMerieux), VersaTREK. Например, для ускоренного выявления возбудителя туберкулеза и автоматизированного определения ЛУ МБТ на баканализаторе ВАСТЕС – MGIT 960 (рис. 14) используются пробирки с жидкой питательной средой, в состав которых включен кислородный флюоресцентный сенсор, обеспечивающий индикацию роста. В процессе развития микобактерий в питательной среде снижается концентрация кислорода, что приводит к увеличению степени флюоресценции индикатора. Ярко-оранжевая окраска, проявляющаяся при освещении пробирок MGIT ультрафиолетом, свидетельствует о положительном результате посева.

Использование данной автоматизированной системы дает возможность получать результаты по выявлению возбудителя и тестированию лекарственной резистентности намного быстрее, чем при использовании традиционных методов и плотных питательных сред. Сочетание культивирования на автоматическом анализаторе с молекулярно-генетическими тестами позволяет провести выявление микобактерий в диагностическом материале, определение их видовой принадлежности и наличие устойчивости/чувствительности к рифампицину (маркеру МЛУ) в течение 7-10 дней. Однако широкое применение культурального метода с использованием автоматизированных систем может быть затруднено из-за дорогостоящего оборудования и питательных сред. Таким образом, существующие традиционные бактериологические методы определения лекарственной чувствительности МБТ требуют значительных затрат времени, в то время как автоматизированные методы являются дорогостоящими. Трудности, связанные с организацией в лаборатории ускоренной диагностики туберкулеза нередко возникают из-за недостаточного финансирования. Поскольку не всегда удается приобрести дорогостоящие автоматизированные системы, то возникает необходимость использования более дешевых методик.

2008

Метки
Bactec АБП Абсцесс Аллергия Альвеолиты Анализы БЦЖ Беременность Биопсия Бронхи Бронхит Бронхоаденит Бронхоблокация Бронхолитиаз Бронхоскопия Бронхоэктазы Брюшина ВИЧ Вакцинация Витамины Гастрит Гепатит Гипертония Глаза Глотка Гортань Дезинфекция Дети Диабет Диспансер Диссеминированный Желудок Закон Зубы Иммунитет Инфильтративный КУМ Кавернозный Казеозная пневмония Кисты Кишечник Классификация Кожа Коллапсотерапия Кости Кровь Курение ЛФК Лаборатория Лазер Лимфогрануломатоз Лимфотропная Лимфоузлы МБТ МЛУ МСЭ Менингит Микобактериоз Микоз Микроскопия Миндалины Мокрота Мониторинг Моча Мочеполовой Наркомания Нервы и психика Обследование Озонирование Опухоль Очаг Очаговый ПТК ПЦР Паротит Патогенетические Первичный Перикардит Печень Питание Пищевод Плазмаферез Плеврит Пневмокониозы Пневмония Побочные Поджелудочная Пожилые Позвоночник Посев Почки Профилактика Пьянство Рак Режимы лечения Рентген Рот Санаторий Санбюллетень Саркоидоз Селезенка Сердце Симптомы Стационар Суставы Трахея Туб. интоксикация Туберкулома Устойчивость ФВД Фиброзно-кавернозный ХНЗЛ Химиотерапия Хирургия ЦНС Цирротический Шок ЭКГ Эмпиема Эндоскопия Язва