Иммунологические методы исследования у больных туберкулезом
А. Г. Хоменко
Оценка состояния основных систем иммунитета, определение их клеточных структур, а также степени развития специфических иммунологических реакций могут помогать в решении ряда задач в клинике туберкулеза: активность процесса, характер течения заболевания, дифференциальная диагностика. Уточнение иммунологического статуса больного важно перед оперативным вмешательством, а также при определении показаний к назначению иммуномодуляторов.
Иммунологические методы применяют для диагностики лекарственной непереносимости, возникающей в процессе химиотерапии. Для оценки иммунного статуса больных используют набор иммунологических методов: тесты оценки состояния Т- и В-лимфоцитов и их субпопуляций (особенно регуляторных) с количественной характеристикой и определением функциональной активности иммунокомпетентных клеток, определение сенсибилизированных к соответствующим антигенам Т- и В-лимфоцитов или их продуктов (медиаторов и антител).
Ценную информацию могут дать исследования, направленные на обнаружение антигенов микобактерий или других микроорганизмов в таком наиболее доступном материале, как кровь [Авербах М. М. и др., 1984]. Важное значение имеет определение факторов неспецифической реактивности, к которым относятся, например, различные компоненты системы комплемента. Широко используются также реакции для определения функции фагоцитов (полинуклеаров и макрофагов, особенно альвеолярных) при легочных заболеваниях, а также различных сывороточных белков, гормонов и др.
Тесты количественной и функциональной оценки Т-лимфоцитов и их субпопуляций. Розеткобразование с бараньими эритроцитами. Установлено, что розетки с эритроцитами барана образуют Т-лимфоциты [Чередеев А. Н., 1976; Jondal М. et al., 1972]. Для постановки данного теста выделяют лейкоцитарную массу путем отстаивания гепаринизированной или дефибринированной крови (спонтанное отстаивание или с добавлением желатина), затем лейкоциты осаждают центрифугированием либо лимфоциты выделяют из цельной крови центрифугированием в градиенте фиколл/гепак (уротраст, изопак, верографин). После этого лимфоциты соединяют с эритроцитами барана и через определенный срок инкубации готовят мазки, которые фиксируют глутаровым альдегидом и окрашивают азурэозином (или просматривают в камере Горяева нативные препараты).
В препаратах определяют процент лимфоцитов, образовавших розетки с эритроцитами (не менее 3 эритроцитов, прикрепившихся к одному лимфоциту). Рекомендуется также пересчет количества розеткообразующих клеток в абсолютных показателях (так как число лимфоцитов в крови при различной патологии, естественно, имеет большие колебания). В норме в крови обнаруживается 50-70% розеткообразующих Т-клеток.
Для определения и подсчета Т-лимфоцитов используют моноклональные антитела (ОКТ или других серий) против маркеров Т-лимфоцитов. Проба состоит из этапов добавления моноклональных антител к взвеси лимфоцитов, антисыворотки против иммуноглобулинов, включающей, например, радиоактивную или флюоресцирующую метку, с последующей ее регистрацией.
Реакция стимуляции Т-лимфоцитов митогенами. Показано, что ряд митогенов, в первую очередь таких, как фитогемагглютинин (ФГА) и конканавалин А (кон-А), вызывают бласттрансформацию и митозы Т-лимфоцитов [Ling М., 1975]. Для постановки теста с ФГА лейкоциты или лимфоциты выделяют описанным выше способом и затем культивируют в присутствии митогена в течение 72 ч. По окончании культивирования готовят мазки, которые окрашивают азурэозином или другим методом и определяют процент властных клеток (молодых клеточных форм) и/или митозы. В норме в культурах с ФГА обнаруживается 60-95% властных клеток.
Другим способом оценки активации лимфоцитов под действием митогенов является определение включения 3Н-тимидина (или других меченых предшественников нуклеиновых кислот или аминокислот) в ДНК. 3Н-тимин добавляют в культуры лимфоцитов за 2-12 ч до конца культивирования. После инкубации клеточную массу отмывают, лизируют NaOH, тиамином или растворителем NCS (для выхода включенной радиоактивности в жидкость), помещают в сцинтилляционную жидкость и определяют число импульсов в опыте (культура с ФГА) и контроле (без ФГА) в жидкостном сцинтилляционном счетчике (например, отечественный счетчик СБС).
Определение субпопуляций Т-лимфоцитов производят различными способами. Существуют способы определения по степени связывания этих клеток с эритроцитами барана (активное, авидное, стабильное, аффинное розеткообразование, гигантские розетки и т. д.), по чувствительности к теофиллину и др. Наиболее признанным и распространенным методом является определение количества Т-хелперов (индукторов и Т-супрессоров) цитотоксических лимфоцитов по наличию на их поверхности рецепторов для Fc-фрагментов IgM и IgG (Тр и Ту-лимфоциты) [Петров Р. В. и др., 1980; Moretta A. et al., 1977].
Для постановки данного теста используют эритроциты быка, покрытые кроличьими антителами класса IgM (для определения Т-хелперов) и IgG (для определения Т-супрессоров). Реакция состоит из нескольких этапов. Вначале выделяют лимфоциты на градиенте фиколл/верографин, от макрофагоподобных примесей освобождаются при инкубации клеток на пластиковых чашках Петри. Неприлипшие лимфоциты смешивают с эритроцитами барана, обработанными нейраминидазой. После инкубации вновь отделяют на градиенте Т-лимфоциты, образовавшие розетки с эритроцитами (в осадке при центрифугировании), от В-лимфоцитов (в интерфазе).
Этот этап можно повторить для лучшей очистки. Розетки разделяют хлоридом аммония или дистиллированной водой, и освобожденные Т-лимфоциты используют в реакции розеткообразования с эритроцитами быка с IgGантителами для определения Ту-лимфоцитов (супрессоров). После 12-часовой инкубации в термостате в культуральной среде, содержащей 15-20% телячьей эмбриональной сыворотки и некоторые добавки, для восстановления IgM-рецепторов Т-клетки используют в реакции розеткообразования с эритроцитами быка, покрытыми IgM-антителами для определения Т-лимфоцитов (хелперов).
Для функциональной оценки субпопуляций Т-хелперов и Т-супрессоров можно разделить эти клетки (после постановки реакций розеткообразования) центрифугированием в том же градиенте фиколя/верографин как это описано выше (см. выделение чистой взвеси Т-лимфоцитов). Получены моноклональные антитела (например, ОКТ4 и ОКТ8 или других серий) для определения Т-хелперов или Т-супрессоров.
Определение супрессорной активности лимфоцитов (мононуклеаров) [по Петрову Р. В. и др., 1980]. Супрессивная активность мононуклеаров может быть определена при активации кон-А, используемого в относительно высокой концентрации или в так называемом спонтанном варианте. В первом случае испытывается действие на реакцию стимуляции тест-лимфоцитов в культуре с ФГА. Лимфоциты выделяют из крови больного (в градиенте фиколл/верографин), инкубируют в течение 24 ч в культуральной среде в присутствии кон-А, затем их рост останавливают митомицином С.
Во втором случае применяют свежевыделенные лимфоциты больного, обработанные митомицином С и предварительно неинкубированные. Тест-лимфоцитами могут служить аутолимфоциты, свежевыделенные из крови больного, либо лимфоциты донора. В разных количествах их смешивают с лимфоцитами, супрессивное действие которых используется, и определяют их активность в стимуляции бласттрансформации или синтеза ДНК в стандартной реакции с ФГА.
Контролями служат: 1) реакция тест-лимфоцитов в «чистой популяции» в присутствии ФГА; 2) то же без ФГА; 3) тест-лимфоциты с ФГА+лимфоциты больного, инкубируемые в культуральной среде в течение того же времени, но в отсутствие кон-А этот этап инкубации занимает 72 ч. О степени активирующего или спонтанного супрессивного действия судят по величине снижения (подавления) реакции стимуляции тест-лимфоцитов в культуре с ФГА. Показателем супрессии служит индекс, вычисляемый разными способами.
По данным Р. В. Петрова и соавт. (1980), у здоровых людей примерно в 13% случаев может быть обнаружена не супрессия, а активация пролиферации тест-лимфоцитов в указанных условиях. Mizarski и соавт. (1981) указывают, что активация чаще происходит при использовании низких концентраций кон-А (5 мкг/мл), при повышении дозы (до 20 мкг/мл) активация может проявляться только при уменьшении (до 24 ч) времени инкубации. Czernicki и соавт. (1981) при обработке мононуклеаров 40 мкг/мл кон-А ни в одном случае не обнаружили активацию. Для оценки специфического клеточного противотуберкулезного иммунитета чаще используют реакции стимуляции лимфоцитов туберкулином (ППД) и торможения миграции лейкоцитов с тем же антигеном.
Реакция стимуляции лимфоцитов с ППД служит для определения степени сенсибилизации к микобактериальным антигенам (реакция обусловлена взаимодействием Т-клеток с ППД). Методика постановки реакции при морфологическом учете бласттрансформации или при оценке степени синтеза ДНК не отличается от учета реакции с ФГА (срок культивирования 96 ч, доза ППД варьирует от 10 до 200 мкг). У здоровых туберкулинотрицательных людей показатель реакции обычно не превышает 1% (при морфологическом учете).
Реакция торможения миграции с ППД предназначена для тех же целей, что реакция бласттрансформации. Лейкоциты получают, центрифугируя плазму, выделенную из крови одним из описанных выше методов (см. постановку реакции бласттрансформации с ФГА). Осадок лейкоцитов набирают в стеклянные капилляры диаметром 1 мм, центрифугируют в них и помещают в культуральные камеры, содержащие питательную среду (контроль) и ППД (опыт). Результат реакции оценивают через 24 ч по соотношению площадей, занимаемых мигрирующими клетками в опыте и контроле. ППД применяют в концентрации 100-200 мкг/мл. У здоровых людей индекс реакции обычно варьирует от 0,8 до 1,2 (в зависимости от дозы антигена и наличия сенсибилизации клеток). Применяют также иные варианты метода, например миграцию лейкоцитов в агарозе [Стрельцов В. П., Владимирский М. А., 1977].
Тесты оценки количества и реактивности В-клеток. Комплементарные розетки. Установлено, что в присутствии комплекса эритроциты — антисыворотка и комплемент розетки с эритроцитами (например, человека) образуют В-лимфоциты [Mendes М. et al., 1973]. Для постановки данного теста лимфоциты выделяют теми же способами, которые описаны выше. Затем тест-эритроциты человека (лучше с кровью группы 0) инкубируют с антиэритроцитарной сывороткой (получаемой от кроликов, иммунизированных эритроцитами человека). Следующий этап — инкубация эритроцитов, нагруженных антиэритроцитарными антителами, с комплементом (источник комплемента — донорская сыворотка крови человека). После этого готовую систему эритроциты — антитела к ним и комплемент соединяют с испытуемыми лимфоцитами, фиксируют их глутаровым альдегидом, делают мазки. Последний этап — окраска и подсчет розеткообразующих лимфоцитов — осуществляют тем же способом, что и при определении Т-розеток. В норме в периферической крови обнаруживают 10-20% комплементарных розеток.
Существуют и другие способы определения и подсчета В-лимфоцитов, основанные на выявлении поверхностных маркеров этих клеток, например по наличию иммуноглобулиновых рецепторов с использованием системы эритроциты + антитела в методе розеткообразования. В-лимфоциты также могут образовывать розетки с эритроцитами мышей, в норме обнаруживается примерно 15-20% таких В-клеток. В последние годы появилась возможность определять количество В-клеток с помощью моноклональных антител, полученных против их маркеров, аналогично определению других популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток.
Определение иммуноглобулинов сыворотки крови методом иммунодиффузии по Mancini и соавт. (1965). Содержание иммуноглобулина в периферической крови отражает функцию В-клеток, поскольку данные белки являются продуктами клеток этой популяции. Для постановки теста исследуемые сыворотки помещают в лунки в агаровом геле, содержащем антииммуноглобулиновые сыворотки (анти-IgG, IgM, IgA). Результат реакции оценивают, измеряя диаметр колец преципитации, после чего вычерчивают график зависимости квадратов радиусов колец преципитации от концентрации исследуемого иммуноглобулина в стандартной сыворотке. Вычислив квадрат радиуса кольца преципитации исследуемой сыворотки и антисыворотки и отложив это значение на графике, можно узнать количество иммуноглобулина в каждой исследуемой сыворотке. Необходимо помнить, что нормальное количество иммуноглобулинов различных классов у здоровых людей варьирует в зависимости от возраста.
Реакция стимуляции В-лимфоцитов липополисахаридом (ЛПС). Известно, что существует ряд митогенов, которые вызывают трансформацию В-клетки (например, ЛПС Е. coli, S. marcesscens, декстрансульфат). Для постановки этого теста лейкоциты и лимфоциты получают описанным выше способом, затем их инкубируют с ЛПС в течение 72-96 ч и готовят мазки, в которых определяют число бластных клеток. Можно также учитывать активность В-лимфоцитов по степени включения 3Н-тимидина, как это описано для постановки РБТ с ФГА. Специфический гуморальный иммунитет можно оценить по количеству антител к антигенам микобактерий, выявляемых в сыворотке крови больных с помощью различных сывороточных тестов.
Реакция агрегатгемагглютинации. Данная реакция является высокочувствительным вариантом реакции пассивной (непрямой) гемагглютинации. Эритроциты обрабатывают глутаровым альдегидом, затем нагружают туберкулином (ППД). В модификации реакции гемагглютинации Миддлбрука — Дюбо туберкулином нагружают нативные, а в модификации Бойдена — обработанные таннином эритроциты. Затем эритроциты соединяют с сывороткой, в которой выявляют противотуберкулиновые антитела. Диагностическим титром, по данным разных авторов, считается 1:8-1:16.
Реакция потребления комплемента (РПК) является модификацией реакции связывания комплемента. В отличие от последней в ней используют комплемент, имеющийся в сыворотке, в связи с чем сыворотки не подвергаются температурной инактивации. Это выгодно отличает данную реакцию от ее прототипа, поскольку температурная обработка нередко снижает титр антител. РПК проводят в два этапа. Первый — взаимодействие антител, имеющихся в сыворотке крови больного, и антигена (например, ППД) и присоединения к комплексу антиген — антитело комплемента, содержащегося в исследуемой сыворотке.
Второй этап — добавление гемолитической системы (эритроциты барана + антисыворотка против эритроцитов барана), с помощью которой регистрируют степень потребления комплемента при первом этапе реакции. Следовательно, чем выше титр специфических антител, тем больше связалось комплемента комплексом антиген — антитело, меньше его осталось в сыворотке и тем в меньшей степени произошел гемолиз бараньих эритроцитов, а следовательно, слабее окраска над осадочной жидкости (интенсивность окраске регистрируют на ФЭК). Титр антител выражают в условных единицах (экстинкция), соответствующих показаниям ФЭК, он равен разнице интенсивности окраски в контроле (к сыворотке вместо антигена добавлен изотонический раствор NaCl и, следовательно, гемолиз наиболее полный) и в опыте» Диагностическим титром считается показатель, равный 0,07.
Определение иммунных розеткообразующих лимфоцитов. Эта методика служит для количественного определения В-лимфоцитов, специфически сенсибилизированных к антигенам микобактерий. Лимфоциты выделяют обычным способом. Эритроциты человека (лучше с кровью группы 0) обрабатывают таннином и ППД. Как и в описанных выше других модификациях теста розеткообразования, эритроциты соединяют с лимфоцитами и определяют число розеток в окрашенных препаратах [Вахидова Г. А., 1977]. У здоровых людей обнаруживается 1-3% таких розеток.
Туберкулинпровокационные тесты. Информативность различных иммунологических методов в значительной степени повышается, если постановку тестов на специфический гуморальный (например, РАГА) и/или клеточный (например, РБТ и РТМ) иммунитет сочетать с подкожным введением ППД (провокация). Иммунологические реакции ставят до и через 48 ч после подкожного введения ППД (в среднем 20 ТЕ детям и 50-100 ТЕ взрослым) [Гергерт В. Я., Борзенко А. С., 1973; Гергерт В. Я., 1984].
А. Е. Рабухин и соавт. (1980), С. М. Лобанова (1982) успешно применили иммуноглобулино-туберкулиновую пробу. Авторы определяли количество иммуноглобулинов классов G, А и М до подкожной провокации ППД, через 48 ч после нее и повторно через 7 дней. Также определяют число иммунных розеткообразующих лимфоцитов в сочетании с подкожной провокацией ППД. Интерпретация результатов иммунологического исследования при туберкулезе приносит наибольшую пользу, если она осуществляется в сопоставлении с клинической характеристикой.
При активном туберкулезе показатели специфических иммунологических тестов обычно бывают положительными. В различные фазы течения активного туберкулеза эти показатели могут значительно варьировать. Так, по результатам, полученным при использовании реакций бласттрансформации и торможения миграции с ППД, первая реакция наиболее выражена при благоприятном течении процесса с быстрым рассасыванием специфических поражений (показатели более 10% властных клеток), а вторая — при прогрессирования процесса (индекс ниже 0,4-0,5) и наоборот. Наиболее высокие титры противотуберкулезных антител (1:256-1:1024) встречаются при выраженной активности процесса и начавшейся положительной динамике.
В эти же сроки можно отметить и самый высокий процент (5-10) обнаружения иммунных розеткообразующих лимфоцитов. По данным В. Я, Гергерта (1984), при вспышке заболевания уровень бластообразования в ответ на ФГА и число Т-розеткообразующих лимфоцитов оказываются сниженными (соответственно 45-60% и 35-50%). В активной фазе туберкулеза несколько повышены (15-25%) содержание В-розеткообразующих лимфоцитов и уровень иммуноглобулинов некоторых классов (чаще IgA и IgG).
Выявление скрытой активности. При минимальной активности туберкулезного процесса показатели иммунитета в основном нормализуются и приближаются по своим значениям к значениям, характерным для лиц с неактивными изменениями или для здоровых людей. В указанный период патологического процесса обычно не отмечается нарушений общих механизмов клеточного и гуморального иммунитета по количественным и функциональным характеристикам, показатели специфических тестов могут быть незначительно более выраженными (РБТ и уровень противотуберкулезных антител) по сравнению с таковыми при неактивном процессе или отрицательными (РТМ).
С помощью так называемых туберкулинпровокационных иммунологических тестов минимальную активность можно установить быстро и в достаточно высоком проценте случаев (75-90, по данным разных авторов). Обычно для этого применяют специфические клеточные иммунологические реакции в сочетании с подкожным введением ППД [Гергерт В. Я., Борзенко А. С., 1973; Рудой Н. М. и др., 1979; Гергерт В. Я., 1984]. Через 48 ч после такой провокации изменение показателей РБТ с ППД в сторону снижения не менее чем на 20% от первоначального уровня и уменьшение индекса РТМ с ППД не менее чем на 0,11 и ниже 0,8 указывают на наличие такой активности.
Результаты подобного исследования могут служить основанием для назначения специфического лечения, его окончания, а также могут быть полезными при дифференциальной диагностике туберкулеза. В комплексе с указанными иммунологическими тестами в сочетании с подкожной туберкулиновой провокацией можно использовать сведения об изменении показателей и других специфических реакций, например таких, как РПГА или определение «иммунных» (к ППД) розеткообразующих лимфоцитов.
Иммуноглобулино-туберкулинпровокационный тест применялся [Лобанова С. М., 1982] для оценки активности туберкулеза легких, при этом учитывались изменения уровня иммуноглобулинов, особенно через 2 сут и неделю после провокации. Постепенное нарастание количества этих белков свидетельствует об отсутствии активности патологического процесса, а резкое повышение (через 48 ч) с последующим снижением (через 7 дней) — о ее наличии.
Оценка эффективности лечения. Оценка иммунологического статуса больных туберкулезом перед лечением может способствовать анализу течения болезни в процессе терапии. Обычно нарушения показателей иммунитета (особенно специфического) соответствуют «протяженности» инфильтрации, распространенности поражений и массивности бактериовыделения [ХоменкоА. Г. и др., 1969, 1981, 1982, 1984]. При этом чем меньше выражены нарушения в системе клеточного иммунитета, чем выше показатели специфического бластообразования и индексы реакции торможения миграции лейкоцитов при невысоком специфическом антителообразовании, тем благоприятнее протекает заболевание, быстрее прекращается бактериовыделение, рассасывание инфильтрации и закрытие полостей распада.
При успешной химиотерапии нарушения характеристик различных систем иммунокомпетентных клеток, как правило, быстро ликвидируются, а показатели специфических иммунологических тестов претерпевают описанные выше изменения, соответствующие благоприятному течению туберкулеза. Наблюдение в динамике позволяет контролировать эффективность лечения. Быстрое и эффективное восстановление показателей иммунитета совпадает по срокам (а иногда и предшествует) с быстро наступающей положительной динамикой. Сохранение нарушений иммунитета, как правило, наблюдается при торпидном, затяжном течении туберкулеза и неэффективной химиотерапии. Так, если в процессе лечения не восстанавливаются до нормы количество и функциональная активность Т-лимфоцитов, у таких больных возможны обострения. Стойкое сохранение подобных дефектов после окончания основного курса лечения должно настораживать клинициста в отношении появления рецидивов.
Иммунологическое исследование, безусловно, необходимо для определения показаний к назначению различных иммуномодуляторов (левамизол, диуцифон, тималин, Т-активин и др.) в комплексном лечении туберкулеза легких, а также в процессе этого лечения с целью контроля эффективности подобной терапии [Хоменко А. Г. и др., 1984; КнорингБ. Е. и др., 1984; Гергерт В. Я. и др., 1986].
1996 г