ПЦР-диагностика туберкулеза
Д.В. Шевчук, О.Е.Кузнецов
В настоящее время все большее внимание уделяется лабораторному методу исследования, основанному на использовании полимеразной цепной реакции. Благодаря применению ПЦР-технологии удается выявить и воспроизвести миллионы копий того участка ДНК, который принадлежит болезнетворному агенту, например, внедрившемуся в организм человека возбудителю туберкулеза, т.е. осуществить анализ на генетическом уровне.
Если «ключевая последовательность» ДНК микобактерии известна, то способом искусственного синтеза можно получить органическое вещество (праймер) с комплиментарной последовательностью азотистых оснований, обеспечивающих способность прикрепляться к одной из нитей ДНК микобактерии в строго определенном месте. Такой «праймер» – копия небольшого (соответствующего 20-30 азотистым основаниям) участка ДНК – является своеобразным «стартовым блоком», с которого под влиянием ДНК-полимеразы происходит удлинение цепи, комплиментарной азотистым основаниям нити материнской ДНК. Для удлинения цепи используются азотистые основания (мононуклеотиды) и другие компоненты, вводимые в реакционную смесь.
Если свойственная праймеру последовательность азотистых оснований характерна только для микобактерий, находящихся в организме человека, то, несмотря на огромное количество присущего человеку генетического материала и малое количество ДНК микобактерий («иголка в стоге сена»), будет создан отрезок комплиментарной цепи, характерный только для болезнетворного агента. Для обнаружения, например, палочки Коха достаточно, чтобы в пробе содержался участок ДНК возбудителя с двумястами парами оснований. Происходит как бы отыскивание иголки в стоге сена («иголка»-это участок ДНК микобактерии, а «стог сена» – сотни миллиардов азотистых оснований нити ДНК клетки). Новообразовавшаяся цепь наполовину состоит из нативной (оригинальной) нити ДНК и наполовину – из новообразованной, комплиментарной (обе нити составляют половинки «лестницы» ДНК).
Исключительное значение метод ПЦР играет в подтверждении туберкулезной этиологии при плевритах, менингитах, туберкулезе мочеполовой системы, туберкулезе лимфоузлов, поскольку результативность бактериологической диагностики в выше указанных случаях крайне низкая.
Если «ключевая последовательность» ДНК микобактерии известна, то способом искусственного синтеза можно получить органическое вещество (праймер) с комплиментарной последовательностью азотистых оснований, обеспечивающих способность прикрепляться к одной из нитей ДНК в строго определенном месте. Такой «праймер» – копия небольшого (соответствующего 20-30 азотистым основаниям) участка ДНК – является своеобразным «стартовым блоком», с которого под влиянием ДНК-полимеразы происходит удлинение цепи, комплиментарной азотистым основаниям нити материнской ДНК.
Если свойственная праймеру последовательность азотистых оснований характерна только для микобактерий, находящихся в организме человека, то, несмотря на огромное количество присущего человеку генетического материала и малое количество ДНК микобактерий («иголка в стоге сена»), будет создан отрезок комплиментарной цепи, характерный только для болезнетворного агента. Исключительное значение метод ПЦР играет в подтверждении туберкулезной этиологии при плевритах, менингитах, туберкулезе мочеполовой системы, туберкулезе лимфоузлов, поскольку результативность бактериологической диагностики в выше указанных случаях крайне низкая.
Большую проблему в ПЦР-диагностике составляют ложноположительные реакции, связанные с контаминацией материала во время забора, доставки в лабораторию и непосредственно во время выполнения исследования. МБТ – повсеместно распространенный патоген, в норме присутствующий в определенных количествах в организме большинства людей после первичного инфицирования. Во вдыхаемом нами воздухе присутствуют как живые МБТ, так и огромное количество их фрагментов и обломков молекул ДНК. В подобных условиях риск контаминации забираемого материала резко возрастает, а количество ложноположительных реакций по данным некоторых авторов может составлять от 1 до 50%.
Единственной возможностью исключения появления ложноположительных реакций при выполнении молекулярно-биологических исследований является стандартизация преаналитического (использование одноразовой лабораторной посуды, РНК и ДНК освобожденной, соблюдение правил асептики и антисептики при взятии биологического материала) и аналитического (соблюдение технологии выполнения молекулярно¬биологического исследования) этапа лабораторного исследования.
