T-SPOT.TB – метод исследования предложенный для замены пробы Манту
T-SPOT.TB – это иммунологический способ диагностики туберкулеза. Способ во многом похож на квантифероновый тест, он занимает 3-4 дня. Для его проведения нужна кровь исследуемого. В России использование методики Т-СПОТ утверждено в 2012 году ФЗ – 2012/648. T-SPOT разрабатывался в Оксфордском Университете и первой на вооружение его приняла Европа, в 2004 году он официально включен в стандарты диагностики туберкулеза в Евросоюзе. США и Канада включили Т-СПОТ в официальную диагностику в 2005 году, Южная Корея в 2006, Тайвань в 2009, Китайская Народная Республика в 2010, Российская Федерация и Япония в 2012 году.
Т-СПОТ.ТБ (Т-SPOT®.ТВ) является тестом для in vitro диагностики туберкулеза путем выявления эффекторных Т клеток, реагирующих на стимуляцию антигеном Mycobacterium tuberculosis, предназначенным в качестве дополнительного средства диагностики туберкулезной инфекции.
Принцип исследования. Мононуклеары периферической крови (МНПК) выделяют из образцов цельной крови и промывают, с целью удаления любых источников фонового сигнала, мешающего учету. Затем МНПК подсчитывают с тем, чтобы в анализируемый образец добавить стандартное количество клеток. Подсчет служит гарантией того, что даже для анализа образцов крови лиц с низкими содержанием Т клеток вследствие ослабления иммунной системы (иммунная недостаточность и иммуносупрессия) в лунки планшета будет добавлено соответсвующее количество клеток. Стадии промывания и подсчета клеток обеспечивают наилучшие условия для выявления больных и инфицированных туберкулезной инфекцией.
МНПК инкубируют с антигеном для стимуляции имеющихся сенсибилизированных Т клеток. Секретированные этими клетками цитокины связываются и удерживаются специфическими антителами, находящимися на поверхности мембраны, выстилающей лунку, остальные клетки удаляются при промывании. Затем специфические антитела, конъюгированные со щелочной фосфатазой и нацеленные на различные эпитопы молекулы цитокина, добавляются для связывания с цитокином, удерживаемым на поверхности мембраны планшета. Несвязанный конъюгат удаляется при промывании. В каждую лунку добавляется раствор субстрата; он расщепляется связанным ферментом и образует пятно нерастворимого преципитата в месте реакции. Каждое пятно является отпечатком одной интерферон гамма-секретирующей Т клетки, а оценка количества полученных пятен является количественной характеристикой содержания сенсибилизированных микобактериями туберкулеза эффекторных Т клеток в периферической крови.
Иммунный ответ на инфицирование М. tuberculosis является преимущественно клеточно-опосредованным. В процессе этого ответа, Т клетки сенсибилизируются к антигенам М. tuberculosis. Активированные эффекторные Т клетки, CD4 и CD8, выделенные из крови, могут быть подсчитаны благодаря способности стимулироваться этими антигенами in vitro 1,2. Применение специально подобранных антигенов ESAT-6 и CFP10, входящих в состав микобактерий комплекса М. tuberculosis (М tuberculosis, М bovis, М africanum), повышает эффективность и специфичность теста, так как эти антигены отсутствуют в БЦЖ и во многих других не вирулентных для человека микобактериях, находящихся в окружающей среде3,4
Т-СПОТ.ТБ (Т-SPOT®. ТВ) является упрощенным вариантом иммуноферментного метода ELISPOT, в котором цитокины связываются буквально рядом с секретирующими их клетками, до растворения в супернатанте и до захвата рецепторами соседних клеток или разрушения. Поэтому анализ ELISPOT значительно более чувствителен, чем традиционно применяемый метод ИФА 5. Т-СПОТ.ТБ (T-SPOT®.TB) предназначен для выявления эффекторных Т клеток, которые отвечают на стимуляцию специфическим антигеном М. tuberculosis3,4,6’9, и позволяет подсчитать отдельные активированные ТБ-специфичные Т клетки. Данный анализ может быть применен для всех пациентов, находящихся в группе риска по латентной туберкулезной инфекции, а также для лиц с подозрением на туберкулез10,11 вне зависимости от их возраста, пола, иммунного статуса, терапии.
Название T-SPOT.TB расшифровывается так:
- литера T обозначает T-лимфоциты, клетки крови, на основе ответа которых производится исследование;
- Слово SPOT это перевод с английского языка, означающий “пятно”. В результате лабораторного опыта в лунке образуются пятна, каждое из которых маркирует Т-лимфоцит;
- .TB это сокращенное международное обозначение туберкулеза.
Этот способ определения носительства туберкулеза очень чувствителен и информативен, он позволяет исключить ложноположительные реакции на носительство микобактерии туберкулеза в случаях, когда большинство тестов ошибаются или неточны. По разным оценкам и в разных регионах земного шара чувствительность Т-СПОТ оценивается от 87 до 97%, информативность также доходит до 97%. Как вы знаете, диагностика туберкулеза у ВИЧ-инфицированных осложнена, а Т-СПОТ в этих случаях весьма информативен и надежен. Есть и другие случаи, в которых использование этого теста предпочтительно.
Показания к предпочтительному исследованию Т-СПОТ:
- у детей, привитых БЦЖ, у которых выявлено ложноположительная реакция Манту. В этом случае ценно сделать это малоинвазивное исследование до рентгенографии легких.
- у лиц с аллергическими и аутоимунными заболеваниями;
- у медицинских работников, людей, которые много путешествуют, военных, беременных;
- у заключенных или прибывших из мест заключения;
- у больных наркоманиями;
- у лиц, контактирующих с туберкулезными больными;
- у пациентов, проходящих терапию подавляющую иммунитет, как например, глюкостероидная или лучевая терапия, лечение с замещением функции почек;
- при наличии хронических заболеваний, сопровождающихся снижением или истощением иммунитета, как например, сахарный диабет, уже упоминавшийся ВИЧ, или пневмокониозы;
- при подозрении на внелегочные формы туберкулеза.
Внимание! Вакцинация БЦЖ не влияет на результаты теста T-SPOT. Важно помнить, что Т-СПОТ является способом количественной диагностики наличия в организме туберкулеза, но не дает возможности отличить активную форму туберкулеза от латентной.
T-SPOT при ВИЧ. Этот тест у носителей ВИЧ имеет особое значение в диагностике туберкулеза. Вирус иммунодефицита поражает как раз те клетки, которые используются для диагностики в любом из IGRA-тестов, к которым относится и T-SPOT, т.е. клетки CD4. В ходе исследований обнаружилось, что даже на поздних стадиях развития ВИЧ, когда количество лимфоцитов CD4 уже не превышает ста на мм3, выявляемость туберкулеза при помощи Т-СПОТ остается очень высокой.
Отличия Т-СПОТ от исследования ПЦР. ПЦР – это исследование ДНК, а так как исследуется именно мокрота, ПЦР исключает возможность определить внелегочные формы туберкулеза. Получается, что Т-СПОТ – универсальный способ диагностики туберкулеза, а ПЦР мокроты специфический. Вероятно поэтому Т-СПОТ, наряду с квантифероновым тестом во всем цивилизованном мире именуют «Золотым стандартом» в диагностике туберкулеза.
Отличия Т-СПОТ от диаскинтеста и квантиферонового теста. C квантифероновым тестом T-SPOT во многом сходен, а вот с диаскинтестом отличий много. Например, Диаскинтест противопоказан лицам с аллергическими и аутоиммунными заболеваниями, он лишен количественных параметров оценки, чаще бывает ложноотрицательным. Диагностика при помощи диаскин-теста невозможна при отсутствии у пациента иммунного ответа на туберкулин.
Квантифероновый тест также хорош и точен как T-SPOT, главное различие в том, что квантифероновый тест определяет гамма-интерферон, вырабатываемый в ответ на внедрение туберкулезной палочки, а Т-СПОТ определяет сами Т-клетки, которые вырабатывают гамма-интерферон на присутствие микобактерии туберкулеза.
Какой тест лучше квантифероновый или Т-СПОТ. Разницы никакой, они одинаково чувствительны и информативны, потому что в одном случае определяется количество Т-клеток, а в другом количество гамма-интерферона, который они выделяют. Стоимость и сроки их проведения также очень похожи.
Как достигается высокая специфичность T-SPOT. Интересно, что вирусологи нашли у вирулентной Микобактерии туберкулеза фрагмент генома, который отсутствует в БЦЖ, используемой для прививки. Лучше диаскин-теста Т-СПОТ в Лабтест Этот фрагмент, называемый RD1, был утрачен в процессе создания вакцины где то между 1908 и 1931 годами. Антигены к RD1 — ESAT-6 и CFP10 избирательно взаимодействуют только с теми Т-клетками, которые “знакомы” с фрагментом RD1. А этого фрагмента нет в обычной прививке. Выяснилось также, что его нет и у микобактерий, которые любят провоцировать ложно-положительную реакцию на туберкулез в здоровом организме, таких как Micobacterium kanzasii, M.marinum, M.szulgai и проч. Все это позволило Т-СПОТ стать надежным и высокоинформативным методом диагностики как латентного, так и активного туберкулеза. Высокая точность диагностики позволяет избежать ненужных и, зачастую, вредных лечебных курсов и исследований.
T-SPOT.TB предназначен:
- Только для диагностики in vitro.
- Только для профессионального применения.
- Закрытый набор реагентов следует хранить при температуре от 2 до 8 °С. После истечения срока годности, обозначенного на этикетке, набор не пригоден для дальнейшего использования.
- Вскрытый набор реагентов допускается хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение 8 недель после вскрытия, но не более срока годности набора.
- Запрещается смешивать компоненты из разных наборов.
- Перед использованием необходимо внимательно прочитать приложенную инструкцию.
- Следует соблюдать правила препятствующие загрязнению реагентов, лунок планшета, клеточных суспензий и клеточной среды.
- Следует избегать изменений рекомендованной техники пипетирования и отмывки, времени инкубации и/или температуры, т.к. они могут повлиять на полученные результаты.
- Кровь у обследуемого лица должна забираться не более, чем за 8 ч до начала исследования.
- Хранение и транспортирование образцов крови в лабораторию производится при температуре от 18 до 25 °С. Образцы цельной крови нельзя ни охлаждать, ни замораживать.
- Т-СПОТ.ТБ (Т-SPOT®.ТВ) следует применять и интерпретировать только совместно с общей клинической картиной. Негативный результат теста не исключает возможности инфицирования М. tuberculosis. Антигены ESAT-6 и CFP10 отсутствуют в штаммах БЦЖ и у большинства микобактерий, циркулирующих в окружающей среде, за исключением М kansasii, М szulgai и М. marinum3,4 и М. gordonae.
Как подготовится к сдаче анализа. За два часа до исследования нельзя есть. Кровь забирают из вены.
Результатом анализа Т-СПОТ.ТБ могут быть три варианта ответа.:
- Отрицательный – организм не инфицирован туберкулёзом («ТБ-отрицательный результат» свидетельствует, что образец вероятно не содержит эффекторных Т клеток, реактивных (специфически сенсибилизированных) к М. tuberculosis)
- Положительный – организм инфицирован туберкулёзом («ТБ-положительный результат» свидетельствует, что образец содержит эффекторные Т клетки реактивные (специфически сенсибилизированные) к М. tuberculosis.)
- Сомнительный – довольно редкий вариант ответа. Необходимо наблюдение в динамике, понадобится повторная сдача анализа или дополнительные методы обследования, например, ПЦР или антитела к туберкулёзу с консультацией фтизиатра.