Выявление микобактерий туберкулеза в материале

bakterioskopianИ.С. Гельберг, С.Б. Вольф

Важное эпидемиологическое и клиническое значение имеет обнаружение микобактерий туберкулеза. Для этого используется различный материал, чаще всего мокрота. Лучше исследовать утреннюю мокроту, при незначительном её количестве рекомендуется собирать мокроту в течение суток. Однако немалая часть больных туберкулезом не выделяет мокроту, поэтому в специализированных учреждениях применяется исследование промывных вод трахеи и бронхов, бронхоальвеолярного смыва.

Широкое распространение должен иметь метод раздражающих ингаляций: 10-15% раствором поваренной соли на 2% растворе соды. Его можно применить везде, вплоть до сельского врачебного участка. Исследуются на МБТ также мазки из зева, моча, кал, выпот из полостей, спинномозговая жидкость, выделения из гениталий, отделяемое свищей, материал, полученный при пункциях и биопсиях, а также бронхоальвеолярный смыв (БАС), полученный при бронхоальвеолярном лаваже.

У больных ограниченными формами туберкулеза в БАС находили МБТ в 2,5 раза чаще, чем в мокроте, L-формы МБТ – также чаще. В последнее время доказана возможность выделения микобактерий из крови при выраженных формах туберкулеза, в том числе у детей и подростков. Используется ряд методов выявления микобактерий в материале.

Бактериоскопические методы

Простая бактериоскопия мазка, окрашенного по Цилю-Нельсену в модификации ВОЗ. Мазок из материала фиксируется на пламени спиртовки или газовой горелки, затем окрашивается карболовым раствором фуксина, после чего обесцвечивается 5% раствором серной кислоты или 3% раствором солянокислого спирта, что приводит к обесцвечиванию всех некислотоустойчивых структур. Затем производится докрашивание 0,25% раствором метиленового синего. Микобактерии обнаруживаются в виде тонких прямых или слегка изогнутых палочек красного или розового цвета, иногда расположенных в виде римской цифры V.

Нередко в теле бактерии или отдельно обнаруживаются более темные зерна (зернистые формы) и др. формы изменчивости МБТ. В настоящее время при положительном результате бактериоскопии пишут – «обнаружены КУБ (кислотоустойчивые бактерии)», т. к. очень редко, но могут встречаться кислотоустойчивые сапрофиты, обычно в моче. При микроскопии мазка, проводимой в обычном микроскопе под иммерсионным объективом, согласно требованиям ВОЗ, необходим просмотр 100 полей зрения, а в некоторых случаях до 300 в течение не менее 10 минут, что повышает выявляемость и достоверность исследования.

В ряде развивающихся стран этот метод является основным при обследованиях на туберкулез. Однако он недостаточно чувствителен (до 10.000-20.000 микробных тел в 1 мл мокроты). Для повышения чувствительности используют методы флотации (применение суспензии материала с более легким, чем вода, углеводородом для всплывания на поверхность микобактерий и микроскопии флотационного кольца) или седиментации (центрифугирование и микроскопия осадка). Наиболее чувствительным является метод люминесцентной микроскопии, когда мазок окрашивается флюоресцирующими красками и микобактерии выглядят в виде светящихся точек в темном поле.

Большое значение имеет бактериологический метод, когда материал засевают на питательную среду и в случае роста культуры МБТ определяют ее чувствительность к противотуберкулезным препаратам. Обычно используются плотные яично-солевые питательные среды (жидкие и полужидкие применяются редко), т. к. на обычных средах микобактерии не растут. В качестве стандартной используется среда Левенштейна-Йенсена, а также её модификации (Гельберга, Финн-2, Аникина и др.).

В настоящее время в Гродненском медуниверситете изучается эффективность более дешевой плотной питательной среды (Кузнецов О.Е., Гельберг И.С.). При этом возможно выявление МБТ при наличии в 1 мл материала нескольких десятков особей. Изредка при низкой жизнеспособности МБТ в условиях химиотерапии возможно выявление их во время бактериоскопии, обычно люминесцентной, при отсутствии роста на питательной среде.

На плотных питательных средах рост колоний появляется обычно на 3-й – 4-й неделе, однако отрицательный ответ выдается через 3 месяца, ввиду возможности замедленного роста при снижении жизнеспособности МБТ. В настоящее время большое значение придается не только самому факту выявления МБТ при посеве, но и количественной оценке. По рекомендации Центрального НИИ туберкулеза России оценка проводится по 3-м степеням: скудное – от 1 до 20 колониеобразующих единиц (КОЕ) по числу видимых колоний, умеренное – 21-100 КОЕ и обильное – более 100 КОЕ. Величина КОЕ рассчитывается как среднее от числа колоний, выросших во всех пробирках.

Определение лекарственной чувствительности МБТ является неотъемлемой частью бактериологического исследования. Обычно вначале из материала получают рост культуры МБТ, затем их засевают на пробирки со средой, содержащей противотуберкулезные препараты. Устойчивость определяется как снижение чувствительности до такой степени, когда данный штамм микобактерий способен размножаться при концентрации в питательной среде препарата на уровне принятого для него критерия устойчивости (критическая концентрация), например, изониазид – 1 мкг/мл, рифампицин – 40 мкг/мл и т.д.

Определяется также видовая принадлежность МБТ: М. tuberculosis или М. bovis и др. при помощи ниацинового теста. Необходимо также идентифицировать атипичные микобактерии.

К классическим методам идентификации микобактерий относятся:

  • изучение цвета колоний (фотохромогенность и др.),
  • скорость роста, быстрорастущие относятся к атипичным, чаще сапрофитным группам,
  • температура – некоторые атипичные микобактерии, например M. kansasii, M. scrofulaceum могут расти и при комнатной температуре, хотя и медленнее, а M. avium-infracellulare и некоторые другие – при 22°, 37°, но также и при 45°.

Большинство нетуберкулезных микобактерий дают рост в виде S- колоний (гладких), тогда как M. tuberculosis и M. bovis – R-колоний (шероховатых), для них нехарактерно наличие кос, жгутов на жидких средах. Ниациновый тест основан на том, что микобактерии человеческого вида выделяют значительно больше никотиновой кислоты (ниацина) чем остальные – 4-17 мкг/мг, в то время как бычьего – всего 0,3-0,9 мкг/мг. Наличие ниацина выявляется с помощью цветной реакции, в том числе на бумажных полосках.

Тест с определением каталазной активности МБТ основан на том, что при прогревании культуры при 68° 30 мин она теряется у туберкулезных и сохраняется у атипичных микобактерий. При этом следует помнить, что устойчивые к изониазиду МБТ исходно теряют каталазную активность.

К современным методам идентификации относятся молекулярно-генетические методы – пробы ДНК и РНК микобактерий, а также метод хроматографии, значительно ускоряющие исследование. Если ниациновый тест занимает до 6 недель, то Gen Probe на РНК или хроматография – 1 рабочий день. В современных условиях определение видовой принадлежности с помощью молекулярно-биологических методов, выявляющих генетические различия, является наиболее быстрым и занимает 1-2 дня.

В настоящее время появились автоматизированные системы для обнаружения МБТ и определения их лекарственной чувствительности к основным противотуберкулезным препаратам (BACTEC, BBL MG IT MB/Bact System), которые позволяют выявлять рост МБТ и определять чувствительность к противотуберкулезным препаратам в 2-3 раза быстрее классических методов. С этой целью используется радиометрический метод, когда в жидкую питательную среду добавляется меченая 14С пальмитиновая кислота, а выделение микобактериями радиоактивного углерода улавливается специальными датчиками.

Применяется и нерадиологический метод, основанный на поглощении кислорода растущей культурой МБТ. Снижение его концентрации в камере приводит к появлению флюоресценции и свечения в ультрафиолетовых лучах. Реже применяется биологический метод, заключающийся во введении патологического материала морской свинке, высокочувствительной к туберкулезной инфекции.

Современным методом является полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на обнаружении специфической ДНК микобактерий туберкулеза и её фрагментов. Расшифровка последовательностей нуклеотидов ДНК дает возможность их идентифицировать. Суть метода заключается в амплификации (клонировании) определенных специфических локусов ДНК микобактерий и выявлении их при помощи синтетических видоспецифических олигонуклеотидов, называемых праймерами. Такие праймеры в настоящее время синтезированы при помощи компьютерной программы.

Обнаруживаются продукты амплификации путем электрофореза при связывании с праймером. Является наиболее чувствительным из существующих методов и позволяет определять 1-10 микобактериальных клеток в 1 мл материала. Специфичность реакции – 97-98%. При помощи ПЦР можно выявить и лекарственную устойчивость. Если традиционными методами лекарственную чувствительность МБТ удается выявить не ранее чем через 1,5-2 месяца, то применение ПЦР позволяет сделать это за несколько (до 2-3) дней.

В настоящее время установлен ряд генов в ДНК МБТ, мутации которых ответственны за развитие устойчивости к основным противотуберкулезным препаратам. Выявление этих мутаций производится путем разработки и применения молекулярнобиологических методов. Число обнаруженных мутаций в генах все время увеличивается и исчисляется многими десятками.

Для выявления МБТ и ЛУ к рифампицину и изониазиду используется метод биологических микрочипов (ТБ-Биочип-2004), её можно выявить у части больных, где при посеве на обычные среды бактериовыделение не обнаруживается. Методу, несомненно, принадлежит большое будущее. В настоящее время его применение сдерживается дороговизной, а также получаемыми изредка ложноположительными результатами. В настоящее время разработаны методы выявления L-форм микобактерий туберкулеза – бактериоскопические, культуральные с применением селективных питательных сред и др.

Метки
Bactec АБП Абсцесс Аллергия Альвеолиты Анализы БЦЖ Беременность Биопсия Бронхи Бронхит Бронхоаденит Бронхоблокация Бронхолитиаз Бронхоскопия Бронхоэктазы Брюшина ВИЧ Вакцинация Витамины Гастрит Гепатит Гипертония Глаза Глотка Гортань Дезинфекция Дети Диабет Диспансер Диссеминированный Желудок Закон Зубы Иммунитет Инфильтративный КУМ Кавернозный Казеозная пневмония Кисты Кишечник Классификация Кожа Коллапсотерапия Кости Кровь Курение ЛФК Лаборатория Лазер Лимфогрануломатоз Лимфоузлы МБТ МЛУ МСЭ Менингит Микобактериоз Микоз Микроскопия Миндалины Мокрота Мониторинг Моча Мочеполовой Наркомания Нервы и психика Обследование Озонирование Опухоль Очаг Очаговый ПТК ПЦР Паротит Патогенетические Первичный Перикардит Печень Питание Пищевод Плазмаферез Плеврит Пневмокониозы Пневмония Побочные Поджелудочная Пожилые Позвоночник Посев Почки Профилактика Пьянство Рак Режимы лечения Рентген Рот Санаторий Санбюллетень Саркоидоз Сердце Симптомы Стационар Суставы Трахея Туб. интоксикация Туберкулома Устойчивость ФВД Фиброзно-кавернозный ХНЗЛ Химиотерапия Хирургия ЦНС Цирротический Шок ЭКГ Эмпиема Эндоскопия Язва

Туберкулез в цифрах и фактах

Туберкулёз — это инфекционное заболевание, вызываемое микобактериями из группы Mycobacterium tuberculosis complex, или иначе — палочками Коха. Чахотка (от слова ...
Подробнее

Полезны ли медицинские маски

Австралийские ученые заявили, что тканевые медицинские повязки не защищают от вирусов и инфекций. Кроме того, использовать их в ситуациях, когда риск ...
Подробнее

Федеральные клинические рекомендации по диагностике и лечению туберкулеза органов дыхания с множественной и широкой лекарственной устойчивостью возбудителя

Васильева И. А    Эргешов А. Э. Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) микобактерий туберкулеза (МБТ)- это устойчивость возбудителя к сочетанию изониазида ...
Подробнее

Клинические рекомендации по диагностике и лечению туберкулеза органов дыхания у взрослых

Яблонский П. К. профессор,д.м.н. Васильева И. А. профессор, д.м.н Основными методами оценки эффективности химиотерапии являются микроскопические и культуральные исследования диагностического ...
Подробнее

Что собой представляет туберкулезный процесс?

Петр Савченко Не торопитесь сказать, что наука знает ответ на этот вопрос. Человек и так совершил много ошибок в спешке ...
Подробнее